JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 2:57 min • July 8th, 2025
Weź szklaną probówkę zawierającą homogenat neutrofili z uwolnionymi składnikami wewnątrzkomórkowymi.
Dodaj metanol, rozpuszczalnik polarny, który zakłóca interakcje lipidowo-lipidowe i lipidowo-białkowe. Nieodłączna polarność metanolu równomiernie rozprowadza polarne lipidy, rozpuszczając je. Następnie dodaj chloroform, niepolarny rozpuszczalnik organiczny, który oddziałuje z niepolarnymi lipidami, powodując ich dyspersję i rozpuszczalność.
Odwirować w celu oddzielenia osadu zawierającego białko od supernatantu zawierającego lipidy, polisacharydy i szczątki komórkowe. Przenieść supernatant do świeżej szklanej probówki. Dodaj chloroform i wodę destylowaną. Odwirować próbkę.
Dodanie wody spontanicznie tworzy dwufazowy system, dzieląc biomolekuły w dolnej warstwie chloroformu i górnej warstwy woda-metanol.
Warstwa chloroformu składa się z rozpuszczonych lipidów niepolarnych, podczas gdy górna warstwa zawiera zanieczyszczenia nielipidowe i bardziej polarne lipidy. Usunąć górną warstwę woda-metanol bez naruszania warstwy zawierającej lipidy.
Użyj koncentratora próżniowego, aby usunąć rozpuszczalnik z lipidów. Przechowywać w niższych temperaturach do czasu dalszego użycia.
Aby wyizolować lipidy z ludzkich neutrofili pochodzenia obwodowego we krwi, należy pobrać przygotowane neutrofile i umieścić je na lodzie. Odpipetować neutrofile do 15-mililitrowej szklanej rurki z nakrętką z uszczelką z PTFE i homogenizować je, wstrząsając przez jedną minutę. Następnie dodaj 2 mililitry metanolu, a minutę później 1 mililitr chloroformu. Po wstrząsaniu przez kolejną minutę obracaj szklane rurki w temperaturze pokojowej i 50 obr./min przez 30 minut.
Następnie otocz frakcję białkową, odwirowując roztwór w temperaturze 7 stopni Celsjusza i 1952 razy g przez 10 minut. Ostrożnie zdekantować supernatant do nowej 15-mililitrowej szklanej rurki z nakrętką, pozostawiając osad zawierający białko. Przechowuj granulki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do przyszłej kwantyfikacji.
Dodaj 1 mililitr chloroformu i odczekaj minutę. Następnie dodaj 1 mililitr podwójnie destylowanej wody i odwróć szklaną rurkę z nakrętką z próbką na 30 sekund. Po odwirowaniu próbki, jak poprzednio, należy usunąć i wyrzucić górną fazę do warstwy mętnej, ale nie włączając jej. Wysuszyć próbki w koncentratorze próżniowym w temperaturze 60 stopni Celsjusza i przechowywać je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu, gdy będą potrzebne.