Test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia infekcji Cryptococcus neoformans w makrofagach

Weź płytkę wielodołkową zawierającą makrofagi.

Dodać Cryptococcus neoformans do studzienek testowych, podczas gdy studzienki kontrolne zawierają tylko makrofagi.

Makrofagi fagocytozy grzyby w fagosomach.

Przemyć buforem w celu usunięcia grzybów niefagocytozowanych. Dodaj pożywkę bez antybiotyków. Inkubować.

Fagosom łączy się z lizosomem, tworząc fagolizosom. Grzyby modulują pH fagolizosomów i posiadają wewnętrzne mechanizmy przetrwania w trudnych warunkach fagolizosomalnych. Grzyby przenikają przez błonę fagolizosomalną i replikują się, czemu towarzyszy cytozolowe nagromadzenie pęcherzyków wypełnionych polisacharydami.

Wewnątrzkomórkowe przebywanie i replikacja grzybów powodują uszkodzenie komórek, uruchamiając szlaki śmierci komórki. Powoduje to lizę makrofagów i uwalnianie treści wewnątrzkomórkowej, w tym dehydrogenazy mleczanowej lub LDH, do pożywki.

Zbieraj pożywki zawierające LDH w różnych punktach czasowych. Poddaj lizie makrofagi kontrolne w podobnych punktach czasowych, aby uzyskać maksymalne uwalnianie LDH w komórkach. Dodać mieszaninę do oznaczania do pobranych pożywek i lizatów. LDH przekształca mleczan w pirogronian, redukując NAD⁺. Diaphoraza redukuje sól tetrazoliową, tworząc czerwony produkt formazanu.

Za pomocą czytnika płytek zmierz absorbancję formazanu w celu ilościowego określenia lizy makrofagów po zakażeniu Cryptococcus neoformans.

Aby przygotować komórki grzybów do infekcji makrofagami, należy zebrać i odwirować komórki C. neoformans z hodowli w środkowej fazie logarytmicznej, a następnie trzy delikatne przemycia 1 mililitrem PBS o temperaturze pokojowej w tych samych warunkach wirówki.

Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić komórki grzybów w stężeniu 1,2 razy 10 do 8 komórek na mililitr, o stężeniu pożywki do hodowli komórkowych bez antybiotyków i dodać 1 mililitr zawiesiny komórek grzybów do każdej z 4 studzienek 70% do 80% zlewającej się 6-dołkowej płytki do hodowli makrofagów. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy godziny. Ostrożnie przechyl płytkę, aby umożliwić trzykrotne delikatne umycie każdej studzienki 1 mililitrem PBS na studzienkę na mycie.

Aby zmierzyć biegłość w infekcjach po ostatnim myciu, dodaj 1 mililitr pożywki wolnej od antybiotyków do każdego dołka płytki 6-dołkowej i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. W odpowiednich eksperymentalnych punktach czasowych zebrać supernatant z każdej studzienki i zmierzyć ilość LDH w każdym dołku zgodnie ze standardowymi protokołami. W tym samym czasie należy przeprowadzić lizę niezakażonych komórek makrofagów, aby określić wartość maksymalnej cytotoksyczności.

Cytotoksyczność można następnie obliczyć przy użyciu wskazanego wzoru.