$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Weźmy dwukomorowy system infekcyjny oddzielony przepuszczalną wkładką membranową. Dolna komora zawiera przylegające ludzkie keratynocyty lub komórki skóry.
Dodaj patogeny bakteryjne w górnej komorze i inkubuj. Błona zapobiega bezpośredniemu kontaktowi patogenów z keratynocytami. Patogeny wydzielają streptolizynę S lub SLS – małą toksynę – która przechodzi przez błonę, aby dotrzeć do komórek.
Kotransporter wodorowęglanu sodu na keratynocytach pośredniczy w napływie jonów wodorowęglanowych i sodu, utrzymując wewnątrzkomórkowe pH. SLS wiąże się z kotransporterem i zaburza transport jonów, prowadząc do wewnątrzkomórkowego stresu osmotycznego.
Sygnalizacja dalsza wywołana stresem powoduje degradację inhibitora związanego z sekwestrowanym czynnikiem jądrowym-Kappa B lub NF-κB, prowadząc do jego aktywacji. Aktywowany NF-κB przemieszcza się do jądra, prowadząc do zwiększenia produkcji cytokin prozapalnych.
Po wydzielaniu zewnątrzkomórkowym cytokiny wiążą się z receptorami śmierci na komórce gospodarza, inicjując martwicę. Po inkubacji należy zebrać supernatant hodowli, aby ocenić wpływ toksyny bakteryjnej.
Bezpośrednio przed zabiegiem należy użyć 1X PBS do przemycia komórek. Następnie nałóż 2 mililitry świeżej pożywki wzrostowej z leczeniem farmakologicznym lub bez niego na płytki sześciodołkowe lub 0,5 mililitra pożywki na dołki płytek 24-dołkowych. Następnie pod okapem z przepływem laminarnym użyj sterylnych kleszczyków, aby ostrożnie umieścić sterylną przepuszczalną wkładkę membranową o grubości 0,4 mikrona w każdej studzience.
Delikatne i sterylne obchodzenie się z przepuszczalnymi wkładkami podczas przygotowywania infekcji ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia uszkodzeniu lub zanieczyszczeniu membrany podczas tego procesu.
Zastosuj świeżą pożywkę do hodowli komórkowych do górnej komory każdej studzienki, zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie nanieść odpowiednią objętość znormalizowanych kultur bakteryjnych do górnej komory systemu wkładów membranowych przepuszczalnych i nanieść pożywkę bakteryjną do studzienek kontrolnych.
Ostrożne dodawanie bakterii do górnej komory, a także delikatny transport zakażonych komórek do inkubatora mają kluczowe znaczenie, ponieważ ważne jest, aby bakterie nie zanieczyściły dolnej komory podczas konfiguracji eksperymentalnej.
Aby ocenić wydzielane białka gospodarza, użyj sterylnych kleszczyków, aby ostrożnie usunąć przepuszczalną wkładkę błony. Następnie, nie naruszając monowarstwy komórek, zbierz pożywkę z dolnej komory do 1,5-mililitrowych probówek.
Odwiruj próbki w temperaturze 14 000 RCF i 4 stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby osadzać szczątki komórkowe. Następnie usuń wszystkie oprócz 50 mikrolitrów supernatantu, przenieś do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub natychmiast zużyj.