Test do badania regulacji fagocytozy makrofagów przez mezenchymalne komórki macierzyste

Pobrać wielodołkową płytkę z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (MSC) w wybranych studzienkach.

Wprowadź makrofagi i inkubuj, ułatwiając interakcję MSC-makrofagi w studzienkach kokulturowych.

Dodaj zymosan - składnik ściany komórkowej drożdży - sprzężony z wrażliwym na pH fluoroforem do wszystkich studzienek.

Receptory wymiatające makrofagi wiążą się z zymosanem, wywołując jego pochłonięcie wewnątrz fagosomu, który łączy się z lizosomem, tworząc fagolizosom.

Kwaśne pH wewnątrz fagolizosomu powoduje, że fluorofor emituje fluorescencję.

W studzienkach do wspólnej hodowli MSC emitują nanorurki tunelowe lub TNT, cytoplazmatyczne przedłużenia, które łączą się z makrofagami. Mitochondria MSC przemieszczają się przez TNT, aby dostać się do makrofagów, zwiększając całkowitą liczbę funkcjonalnych mitochondriów.

Podwyższona liczba mitochondriów zwiększa produkcję adenozynotrójfosforanu lub ATP, który napędza zapotrzebowanie na energię do wzrostu fagocytozy.

Zapisz intensywność fluorescencji w czasie z uwewnętrznionych zymozanów sprzężonych z fluoroforem.

Wspólna hodowla wykazuje zwiększoną fluorescencję w porównaniu ze studzienkami zawierającymi tylko makrofagi, co wskazuje na wzmocnienie fagocytozy makrofagów za pośrednictwem MSC.

Delikatnie odessać pożywkę z dołków doświadczalnych zawierających mezenchymalne komórki macierzyste. Za pomocą wielokanałowej mikropipety dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórek makrofagów poddanych działaniu substancji i kontrolnych do odpowiednich studzienek doświadczalnych zgodnie z projektem płytki i inkubować przez noc, jak pokazano. Dodać jeden mililitr pożywki do obrazowania żywych komórek do fiolki zawierającej jeden miligram cząstek zymosanu i zebrać mieszaninę cząstek pożywki do szklanej probówki hodowlanej.

Po przepłukaniu fiolki dodatkowym mililitrem roztworu do obrazowania, przepłukany środek do obrazowania przenieść do szklanej probówki. Następnie dodaj 3 mililitry dodatkowego roztworu do obrazowania, aby uzyskać 0,2 mg/ml zawiesiny cząstek zymozanu. Wiruj zawiesinę zymosanu za pomocą szybkich impulsów przez 30 do 60 sekund. Następnie użyj sonikatora sondy, aby sonikować zawiesinę za pomocą 60 szybkich impulsów. Po zassaniu pożywki przepłukać dołki eksperymentalne w studzienkach ślepej próby odczynnika 100 mikrolitrami roztworu do obrazowania żywych komórek.

Następnie odessać roztwór do obrazowania żywych komórek ze studzienek i dodać 100 mikrolitrów zawiesiny zymozanu. Otwórz tacę na płytki czytnika fluorescencyjnego za pomocą interfejsu panelu dotykowego. Umieść talerz bez pokrywki w tacce z dołkiem A1 w lewym górnym rogu. Zamknij tacę za pomocą panelu dotykowego i kliknij zielony przycisk "Czytaj" w górnym menu.