JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 2:36 min. • July 8th, 2025
Uzyskać kulturę w pełni zróżnicowanych makrofagów na płytce wielodołkowej. Te makrofagi mają markery powierzchniowe, takie jak receptory toll-podobne lub TLR-2 - receptor rozpoznawania wzorców, który identyfikuje różne składniki drobnoustrojów.
Dodać odpowiednią ilość znakowanej fluorescencyjnie zawiesiny Mycobacterium tuberculosis lub komórek Mtb do każdej studzienki i inkubować.
TLR-2 rozpoznaje lipoarabinomannan lub LAM, złożony składnik glikolipidowy ściany komórkowej Mtb, inicjujący fagocytozę. Makrofag internalizuje Mtb, sekwestrując bakterię w fagosomie - przedziale związanym z błoną.
Fagosom dojrzewa poprzez fuzję z lizosomami, tworząc fagolizosom - kwaśny i bogaty w enzymy przedział.
W fagolizosomie Mtb hamuje pompę protonową typu wakuolarnego odpowiedzialną za wytwarzanie kwaśnego pH. W konsekwencji pH w fagolizosomie staje się prawie neutralne, dezaktywując enzymy, które rozkładają pochłonięte patogeny.
Interakcja między LAM i TLR2 wpływa również na szlaki sygnałowe komórek gospodarza, prowadząc do modulacji markerów powierzchniowych zaangażowanych w prezentację antygenu.
Inaktywacja fagolizosomu i hamowanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza umożliwiają Mtb utrzymywanie się i replikację w makrofagach.
Aby zainfekować komórki pochodzące z monocytów, rozcieńczyć bakterie do 5 razy 10 do szóstych jednostek tworzących kolonie na mililitr stężenia w pożywce bez surowicy i zastąpić supernatant w każdym dołku sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej 1 mililitrem świeżej pożywki bez surowicy i 1 mililitrem zawiesiny bakterii na studzienkę, aby uzyskać wielokrotność infekcji 5.
Po 4-godzinnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 1 mililitrem sterylnego buforu do płukania na przemycie, ostrożnie przechylając płytkę, aby po każdym przemyciu usunąć całą objętość buforu z rogów studzienek. Następnie ponownie zawieś zakażone MTb komórki pochodzące z monocytów w 2 mililitrach kompletnej pożywki bez antybiotyków.