Test do badania roli witronektyny w przyleganiu bakterii do komórek nabłonka gospodarza

Weź płytkę wielodołkową zawierającą przylegające monowarstwy komórek nabłonka. Zastąp pożywkę pożywką niezawierającą surowicy, zapobiegając interferencji białek surowicy. Po inkubacji usuń pożywkę. Umyj komórki buforem. Dodać schłodzone podłoże bez surowicy zawierające witronektynę. Inkubować w niższych temperaturach.

N-końcowa domena RGD witronektyny wiąże się z receptorami integryny na powierzchni komórki nabłonka. Niższe temperatury hamują internalizację komórkową kompleksu witronektyna-integryna.

Po wysyceniu receptora integryny usuń pożywkę. Przemyć buforem w celu usunięcia nadmiaru witronektyny, który może wpływać na bakteryjne wiązanie integryny zależnej od witronektyny.

Dodać zawiesinę Haemophilus influenzae typu f lub Hif, bakterii Gram-ujemnych. Inkubować.

Białko H na powierzchni Hif wiąże się z C-końcem witronektyny, ułatwiając przyleganie Hif do komórki nabłonka i późniejszą internalizację.

Usuń nośnik i umyj buforem, aby usunąć niezwiązany Hif. Użyj enzymu odłączającego komórki, aby zebrać komórki. Dodaj pożywkę zawierającą surowicę, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Przenieść zawiesinę komórek do szklanej rurki zawierającej szklane kulki. Wir do lizy komórek, uwalni