Określenie roli witronektyny w oporności bakterii na działanie bakteriobójcze surowicy ludzkiej

Aby zbadać wpływ witronektyny – ludzkiej glikoproteiny surowicy – na bakterie, należy zacząć od probówek zawierających zawiesinę Haemophilus influenzae.

Potraktuj jedną probówkę normalną ludzką surowicą zawierającą witronektynę, a drugą surowicą zubożoną w witronektynę. Oba warianty surowicy zawierają przeciwciała i różne białka dopełniacza – niezbędne do działania bakteriobójczego.

Podczas inkubacji przeciwciała oddziałują z białkami powierzchniowymi bakterii, aktywując białka dopełniacza w celu utworzenia konwertazy C5, która rozszczepia C5. C5b wiąże się z C6, a następnie C7, tworząc kompleks C5b6-7. Kompleks ten wiąże się z błoną komórkową bakterii i rekrutuje C8, tworząc C5b67-8.

Proces ten ułatwia przyłączanie monomerów C9 i ich polimeryzację, generując kompleks ataku błony — strukturę tworzącą pory. Pory te powodują napływ jonów i wody, co prowadzi do lizy bakteryjnej.

Natomiast w probówce z normalną surowicą witronektyna wiąże się z bakteryjnym białkiem powierzchniowym, które oddziałuje z kompleksem C5b6-7 i monomerami C9. Interakcje te zapobiegają rekrutacji C8 i polimeryzacji C9, hamując tworzenie kompleksu ataku błonowego i prowadząc do przeżycia bakterii.

Pobrać zawiesinę bakteryjną zarówno z probówek, jak i hodowli na poszczególne płytki agarowe.

Większa liczba kolonii bakteryjnych w surowicy zawierającej witronektynę potwierdza jej rolę w oporności bakterii na działanie bakteriobójcze surowicy ludzkiej.

Aby przeprowadzić analizę zależnej od witronektyny oporności na działanie bakteriobójcze surowicy ludzkiej, najpierw należy przeprowadzić hodowlę i osadzanie bakterii zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad bakteryjny z 1 objętością buforu weronalnego żelatyny dekstrozy. Teraz dodaj 1,500 CFU bakterii do 100 mikrolitrów DGVB++ zawierających 5% surowicy.

Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, wytrząsając przy 300 obr./min. Usunąć 10-mikrolitrową podwielokrotność z mieszaniny reakcyjnej po 0 minutach i 15 minutach. Umieść porcję na agarze czekoladowym i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji płytek z agarem czekoladowym należy policzyć kolonie pojawiające się na płytce i obliczyć procent zabitych bakterii zgodnie z opisem w protokole tekstowym.