Model zakażenia błony śluzowej szyjki macicy u człowieka do badania patogenezy HIV w warunkach ex vivo
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 4:51 min • July 8th, 2025
Umieść błonę śluzową macicy szyjki macicy na szalce Petriego. Oddziel błonę śluzową szyjki macicy i szyjki macicy od błony podśluzowej. Pokrój warstwę błony śluzowej na mniejsze eksplantaty i przenieś je do stożkowej probówki.
Dodaj ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 lub HIV-1 do probówki z eksplantatem. Cząsteczki wirusa HIV-1 zbliżają się do odsłoniętej warstwy błony śluzowej i wiążą się z receptorem CD4 i koreceptorem CXCR4 na komórce gospodarza.
Po związaniu otoczka wirusa łączy się z błoną komórkową gospodarza, uwalniając kapsyd wirusa zawierający wirusowe RNA i enzym odwrotnej transkryptazy do cytoplazmy. Wewnątrz cytoplazmy odwrotna transkryptaza przekształca wirusowe RNA w komplementarne DNA lub cDNA.
cDNA przemieszcza się do jądra komórki gospodarza, gdzie integraza włącza DNA wirusa do genomu gospodarza. DNA wirusa kieruje syntezą nowego wirusowego RNA i białek, które łączą się w nowe cząsteczki wirusa. Cząsteczki te odrywają się od komórki gospodarza, uzyskując otoczkę lipidową.
Przepłukać eksplantaty odpowiednim buforem, aby usunąć wszelkie niezwiązane wirusy. Na koniec umieścić eksplantaty na gąbce żelatynowej na płytce wielodołkowej z odpowiednim podłożem i inkubować.
Interfejs powietrze-ciecz maksymalizuje ekspozycję na tlen i dostęp składników odżywczych przez naczynia włosowate gąbki, zwiększając żywotność modelu na potrzeby dalszej analizy.
Użyj pokrywki szalki Petriego jako powierzchni tnącej do wycięcia tkanki. Delikatnie przytrzymując tkankę kleszczami, oddziel błonę śluzową szyjki macicy i/lub szyjki macicy od podścieliska i podśluzówki za pomocą skalpela i ostrza, aby uzyskać paski błony śluzowej. Pokrój błonę śluzową w paski o szerokości 2 milimetrów. Usuń i wyrzuć jak najwięcej błony podśluzowej, pozostawiając tylko warstwę tkanki o grubości 2 milimetrów. Następnie pokrój paski na bloki o grubości 2 milimetrów.
Przenieś eksplantaty tkanek na nową 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą od 10 do 20 mililitrów CMT, aby uniknąć wysuszenia tkanek podczas kontynuowania sekcji. Pod koniec sekcji zakręć płytką, aby losowo określić rozkład eksplantatów. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś eksplantaty do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Usunąć wszelkie medium z probówki za pomocą pipety.
Aby uzyskać optymalne rezultaty, eksplantaty szyjki macicy powinny być przetworzone i zakażone jak najszybciej po zabiegu, najlepiej w dniu zabiegu. Alternatywnie, tkanki mogą być przechowywane zanurzone w CMT w temperaturze 4 stopni przez noc i zakażone natychmiast po sekcji.
Preparat HIV-1 rozmrozić w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu przenieś wirusa do probówek zawierających eksplantaty. Przenieś probówki do wytrząsarki termicznej i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, kołysząc się z prędkością 300 obr./min. Delikatnie odwróć rurki kilka razy co 30 do 60 minut.
W międzyczasie napełnij sześciodołkową płytkę 3 do 4 mililitrami sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami na studzienkę. Pod koniec inkubacji z HIV-1 za pomocą pipety wyrzucić cały preparat wirusowy z probówek zawierających eksplantaty do pojemnika z roztworem dezynfekującym. Następnie za pomocą kleszczy i pipety przenieś eksplantaty do sześciodołkowej płytki zawierającej PBS.
Po pozostawieniu eksplantatów na jedną minutę w PBS w temperaturze pokojowej, umyj je, delikatnie pipetując PBS w górę iw dół do studzienki dwa do trzech razy. Następnie wyrzuć PBS do pojemnika z roztworem dezynfekującym za pomocą pipety. Dodaj 3 do 4 mililitrów nowego PBS do każdej studzienki. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania. Wyrzuć PBS tuż przed przeniesieniem eksplantatów do gąbek, aby uniknąć wysuszenia tkanek.
Teraz użyj kleszczy, aby przenieść od pięciu do ośmiu eksplantatów na wierzchu każdej gąbki żelatynowej na 12-dołkową płytkę. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje metodę badania infekcji HIV-1 w eksplantach błony śluzowej szyjki macicy. Protokół podkreśla znaczenie zachowania żywotności tkanek na potrzeby dalszych analiz.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Choroby zakaźne
- Biologia komórki
Wstęp
- HIV-1 stanowi istotny problem zdrowotny w skali globalnej.
- Zrozumienie mechanizmów jego infekcji jest kluczowe dla opracowania strategii terapeutycznych.
- Błona śluzowa szyjki macicy jest ważnym miejscem wniknięcia HIV-1.
- Modele eksplantów mogą dostarczyć wiedzy na temat oddziaływań wirusa z tkankami gospodarza.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu eksplantu do badania infekcji HIV-1.
- Zbadanie mechanizmów wiązania i wnikania HIV-1 do tkanek szyjki macicy.
- Pogłębienie zrozumienia patogenezy HIV-1 w tkankach śluzówkowych.
Zastosowane metody
- Izolacja błony śluzowej egzocervix i endocervix z błony podśluzowej.
- Przygotowanie eksplantów tkankowych do infekcji wirusowej.
- Infekcja eksplantów wirusem HIV-1 i inkubacja w kontrolowanych warunkach.
- Przemywanie i przenoszenie eksplantów do odpowiedniego medium w celu analizy.
Główne wyniki
- Z powodzeniem przeprowadzono infekcję eksplantów szyjki macicy wirusem HIV-1.
- Mechanizmy wnikania wirusa scharakteryzowano przy użyciu eksplantów.
- Model wykazał żywotność umożliwiającą dalsze analizy.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia oddziaływań HIV-1 z tkankami śluzowymi.
Wnioski
- Model eksplantu jest skuteczny w badaniu infekcji HIV-1 w tkankach szyjki macicy.
- Metoda ta może pomóc w opracowaniu interwencji terapeutycznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym modelu w celu zgłębienia dodatkowych aspektów patogenezy HIV-1.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten model błony śluzowej szyjki macicy człowieka ex vivo umożliwia analizę mechanizmów wnikania HIV-1 oraz wczesnej patogenezy na fizjologicznie istotnej barierze śluzowej. Dzięki zachowaniu architektury tkanki i oddziaływań komórkowych system ten wspiera walidację celów oraz ograniczanie ryzyka w przypadku inhibitorów wnikania lub szczepionek śluzówkowych. Stanowi on istotny w kontekście ludzkim system łączący wyniki badań in vitro z efektywnością in vivo, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac w procesach odkrywania leków przeciwwirusowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezpośrednią obserwację wiązania HIV-1 z receptorami CD4 i CXCR4 na pierwotnych ludzkich komórkach śluzówkowych, co pozwala na walidację mechanizmów angażowania celu.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje przygotowanie eksplantu, które utrzymuje żywotność tkanki w celu przeprowadzenia dalszych analiz replikacji wirusa i odpowiedzi gospodarza.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Wspiera ilościową ocenę kinetyki wnikania i replikacji wirusa w kontrolowanych warunkach interfejsu powietrze-ciecz.
- Wartość operacyjna: Zestandaryzowane etapy płukania i przenoszenia redukują zmienność, umożliwiając powtarzalny screening związków lub przeciwciał w tkance śluzowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje patogenezę HIV-1 w błonie śluzowej, umożliwiając ocenę potencjalnych środków terapeutycznych blokujących fuzję wirusa, odwrotną transkrypcję lub integrację w tkance ludzkiej.
- Wartość operacyjna: Hodowla na gąbce żelatynowej na granicy faz powietrze-ciecz podtrzymuje żywotność eksplantu, co ułatwia podłużne odczyty w badaniach nad skutecznością przedkliniczną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację wiodących związków, dostarczając danych z tkanek ludzkich w celu priorytetyzacji kandydatów przed rozpoczęciem badań na zwierzętach.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących mechanizmów wnikania HIV-1 oraz zależności od czynników gospodarza w pierwotnej śluzówce szyjki macicy człowieka.
- Przesiew: Umożliwia ocenę inhibitorów wnikania lub immunogenów śluzówkowych z wykorzystaniem mierzalnej ilości wirusa jako odczytu.
- Analityka: Generowanie pomiarów viralnego RNA, ekspresji białek lub uwalniania cząstek w celu porównania warunków infekcji.
- Badania translacyjne: Łączenie wyników uzyskanych z eksplantów śluzówki z modelami przedklinicznymi poprzez walidację istotności celu w tkance ludzkiej.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzenie platformy wielokrotnego użytku do badania innych patogenów przenoszonych drogą płciową lub kandydatów na szczepionki śluzówkowe.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w zakażeniu HIV-1 poprzez wykorzystanie fizjologicznie istotnej ludzkiej tkanki śluzówkowej.
- Wartość operacyjna: Zestandaryzowane protokoły przygotowania i inkubacji eksplantów wspierają odtwarzalność między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez przewidywanie skuteczności interwencji ukierunkowanych na wnikanie w obrębie błon śluzowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o dane z walidacji na ludzkiej tkance.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza w zakresie postępowania z tkankami ludzkimi, preparatyki błon śluzowych oraz sterylnych technik wirusologicznych.
- Zależność od dostępu do świeżej tkanki szyjki macicy, szczepów HIV-1 oraz kontrolowanego sprzętu inkubacyjnego (inkubator z wytrząsaniem, inkubator).
- Konieczność stosowania ustandaryzowanych procedur operacyjnych podczas przygotowywania, płukania i przenoszenia eksplantów w celu zminimalizowania zmienności.
- Adaptacja do innych tkanek śluzowych może wymagać optymalizacji warunków preparatyki i hodowli.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność między dawcami tkanek oraz ograniczony czas życia eksplantów, co wymaga ich niezwłocznego wykorzystania po preparatyce.
FAQ Biofarmaceutyczne
Model koinfekcji In vitro do badania interakcji między Plasmodium falciparum a HIV-1 w ludzkich pierwotnych komórkach odpornościowych pochodzących z monocytów
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Opracowanie modelu hodowli komórkowej in vitro dla jednoczesnego zakażenia malarią i HIV
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ex vivo Zakażenie mysiego naskórka wirusem opryszczki pospolitej typu 1
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ex vivo Zakażenie ludzkiej tkanki limfatycznej i błony śluzowej żeńskich narządów płciowych ludzkim wirusem niedoboru odporności 1 i histokultura
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Humanizowany mysi modelNOD/SCID/IL2rγ null (hu-NSG) do badań replikacji i latencji HIV
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Opracowanie podwójnego humanizowanego modelu myszy TK-NOG dla patogenezy wątroby związanej z HIV
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Przewlekłe, ostre i reaktywowane zakażenie wirusem HIV w humanizowanych modelach myszy z niedoborem odporności
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Humanizowane myszy NOG do dopochwowej ekspozycji na HIV i leczenia zakażenia HIV
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026