JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 4:45 min • July 8th, 2025
Zacznij od znieczulonej myszy, której wstrzyknięto dootrzewnowo lipopolisacharyd w celu wywołania stanu zapalnego.
Naciąć brzuch, aby odsłonić jamę brzuszną. Utrzymuj nawodnienie narządów za pomocą soli fizjologicznej. Wstrzyknąć rodaminę 6G po orbicie. Cząsteczki barwnika fluorescencyjnego dostają się do krążenia i znakują leukocyty i płytki krwi w celu ich wizualizacji.
Teraz uzewnętrznij pętlę jelita krętego z naczyniami krezkowymi. Utrzymuj nawodnienie tkanki za pomocą wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej, aby uzyskać optymalne obrazowanie. Pod mikroskopem fluorescencyjnym skoncentruj się na żyle krezki do mikroskopii przyżyciowej.
Iniekcja lipopolisacharydu powoduje aktywację komórek śródbłonka z regulacją w górę cząsteczek adhezyjnych, w tym selektyn. Krążące płytki krwi są rekrutowane do śródbłonka, gdzie wiążą się poprzez specyficzne interakcje cząsteczka-ligand adhezyjny, tworząc kompleksy adhezyjne
.Dzięki tym interakcjom płytki krwi uaktywniają się i uwalniają granulki zawierające cząsteczki, w tym serotoninę, sprzyjające rekrutacji leukocytów.
Leukocyty przemieszczają się na powierzchnię śródbłonka i wiążą się z aktywowanymi płytkami krwi. Ponadto leukocyty toczą się wzdłuż śródbłonka i wiążą się z komórkami śródbłonka poprzez słabe oddziaływania adhezyjne. Ruch toczny aktywuje integryny leukocytów w celu silnego przylegania do komórek śródbłonka, co ma kluczowe znaczenie dla transmigracji leukocytów-śródbłonka.
Za pomocą mikroskopii przyżyciowej wizualizuj fluorescencyjne leukocyty i płytki krwi, aby określić ich interakcje w czasie rzeczywistym z komórkami śródbłonka.
Cztery godziny przed obrazowaniem przyżyciowym wstrzyknij 20 miligramów na kilogram LPS IP 16-20-gramowemu samcowi myszy w wieku od 4 do 6 tygodni, aby wywołać pozorowaną bakteryjną odpowiedź zapalną.
W tym czasie należy podgrzać 0,9% roztwór soli fizjologicznej w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby nawilżyć plastikową komorę i tkankę krezkową. Następnie należy potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u myszy leczonej LPS, a następnie nałożyć maść na oczy zwierzęcia.
Wypiluj brzuch golarką, usuwając luźne włosy gazą nasączoną 70% etanolem. Następnie użyj małych zakrzywionych kleszczy i nożyczek, aby otworzyć brzuch.
Zidentyfikuj naczynia nadżołądkowe i otwórz otrzewną w okolicy kresy białej, aby chronić naczynia. Nałóż kilka kropli wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej do jamy brzusznej, aby utrzymać wilgotność tkanki, a następnie wstrzyknij 50 mikrolitrów rodaminy 6G za pomocą oczodołu, aby oznaczyć krążące krwinki. Następnie umieść mysz na 10-centymetrowej szalce Petriego, zewnętrzizuj pętlę jelita krętego i podawaj wstępnie podgrzaną sól fizjologiczną co drugą minutę, aby tkanka była wilgotna.
Aby uwidocznić reakcję zapalną za pomocą mikroskopii przyżyciowej, umieść mysz pod mikroskopem i umieść żyłę krezkową o średnicy od 200 do 300 mikrometrów i jak najmniej widocznej otaczającej tkanki tłuszczowej w polu widzenia.
Za pomocą odpowiedniego oprogramowania mikroskopowego rejestruj interakcje między komórkami krwi a śródbłonkiem przez 1 minutę w 4 różnych żyłach na mysz. Następnie, aby przeanalizować odpowiedzi między komórkami, potwierdź stabilne i międzyosobnicze warunki przepływu krwi.
Aby określić ilościowo liczbę toczących się leukocytów, narysuj pionową linię przechodzącą przez żyłę i ręcznie policz wszystkie leukocyty, które przekraczają tę linię w ciągu 1 minuty. Aby określić prędkość toczenia, narysuj dwie pionowe linie przez żyłę oddaloną od siebie o 50 mikrometrów i zmierz czas, w którym pojedynczy leukocyt przechodzi między liniami, stabilnie tocząc się po śródbłonku.
Aby zmierzyć adhezję leukocytów, narysuj kwadrat o wymiarach 200 na 200 mikrometrów w żyle. Następnie ręcznie policz mocno przylegające leukocyty, które nie wykazują widocznego ruchu w kwadracie przez 30 sekund. Wreszcie, aby określić ilościowo interakcje płytk-leukocyty, ręcznie policz liczbę płytek krwi związanych z jednym leukocytem.