Przygotowanie i oznaczanie ilościowe inokulum Mycobacterium bovis BCG lux do zakażenia

Zacznij od rozmrożonej kultury Mycobacterium bovis BCG lux, genetycznie zmodyfikowanego bioluminescencyjnego szczepu atenuowanego Mycobacterium bovis wykazującego ekspresję enzymu reporterowej lucyferazy.

Zaszczepić zawiesinę w kolbie hodowlanej zawierającej pożywkę wzrostową uzupełnioną higromycyną z antybiotykiem. Inkubować. BCG lux jest nosicielem genu oporności na higromycynę, co ułatwia jego przetrwanie i wzrost.

Po inkubacji przygotować odpowiednie rozcieńczenia kultur za pomocą buforu w probówkach z luminometrem. Przenieść do luminometru, obciążonego długołańcuchowym roztworem substratu aldehydu alifatycznego. Podczas biegu aldehyd jest wstrzykiwany do zawiesiny prątków, która dostaje się do komórek.

Lucyferazy bakteryjne katalizują utlenianie endogennego zredukowanego mononukleotydu flawinowego i aldehydu, powodując emisję światła niebiesko-zielonego. Zmierzona intensywność bioluminescencji wskazuje na aktywność metaboliczną luksów BCG i koreluje z miarą żywotnych bakterii lub jednostek tworzących kolonie, CFU.

Następnie odwiruj pozostałą kulturę prątków. Zawiesić osad prątków w buforze zawierającym niejonowy środek powierzchniowo czynny, aby zapobiec zbrylaniu się prątków.

Korzystając z pomiarów bioluminescencji, rozcieńczyć zawiesinę, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek. Przygotować seryjne rozcieńczenia prątków i umieścić je na płytkach agarowych z dodatkiem higromycyny odżywczej. Inkubuj, pozwalając luksom BCG na tworzenie kolonii.

Obliczyć CFU, aby potwierdzić korelację z intensywnością bioluminescencji. Przygotowany inokulum BCG lux może być wykorzystany do badań nad infekcjami.

Na początek rozmrozić zamrożony 1,2-mililitrowy zapas glicerolu Mycobacterium bovis BCG lux. Szczep szczepionki Montreal przekształcił się w plazmid wahadłowy PSMT-1 przenoszący geny luxAB. W oznakowanej 250-mililitrowej kolbie Erlenmeyera zaszczepij 15 mililitrów bulionu Middlebrook 7H9 rozmrożoną 1,2-mililitrową porcją BCG lux.

Umieścić kolbę w szczelnie zamkniętym pojemniku bezpieczeństwa biologicznego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną z prędkością 220 obr./min przez 72 godziny. Po inkubacji przygotować od jednego do 10 rozcieńczeń kultury w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami w probówkach z luminometrem. Wiruj i załaduj rurki luminometru do luminometru.

Załaduj substrat 1% aldehydu n-decylowego w absolutnym etanolu do platformy wtryskiwacza i zmierz bioluminescencję. Przekształć bioluminescencję w jednostki tworzące kolonie, aby sprawdzić wzrost kultury luksów BCG.

Przenieść kulturę do probówki wirówkowej i wirować z prędkością 2,175 razy g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek. Wyrzucić supernatant do odpowiedniego środka dezynfekującego o znanym działaniu prątkobójczym. Przemyj osad komórkowy dwukrotnie w 50 mililitrach PBS-T, wirując 2,175 razy g przez 10 minut, aby zapobiec zbrylaniu się bakterii.

Po ostatnim przemyciu zdekantować supernatant odpadowy i ponownie zawiesić osad komórek prątków w wymaganej objętości PBS-T w celu rozcieńczenia zawiesiny prątków do pożądanej gęstości komórek. Następnie należy przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia inokulum na płytkach 24-dołkowych przy użyciu PBS-T.

Umieścić 10 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych Middlebrook 7H11 w dwóch egzemplarzach, aby wyliczyć liczbę CFU inokulum.