Technika tworzenia modelu infekcji bakteryjnej u larw owadów

Umieść larwę Galleria mellonella - dużej woskowej - na platformie iniekcyjnej, odsłaniając stronę brzuszną.

Weź mikrostrzykawkę zawierającą zawiesinę Mycobacterium bovis BCG lux — żywego szczepu bakterii szczepionkowego zmodyfikowanego genetycznie w celu uzyskania bioluminescencji. Wstrzyknąć zawiesinę w ostatni proleg lub przydatki brzuszne - uwalniając bakterie do hemolimfy - płynu krążącego w jamie ciała.

Przenieś larwę do kontrolowanego środowiska i wysiaduj. Bakterie wykorzystują hemolimfę jako bogate źródło składników odżywczych i namnażają się.

Hemocyty - bezkręgowe komórki odpornościowe w hemolimfie - skupiają się wokół bakterii, tworząc strukturę podobną do ziarniniaka, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się infekcji. Hemocyty uwalniają pro-fenooksydazę, która ulega rozszczepieniu proteolitycznemu, tworząc fenooksydazę.

Oksydaza fenolowa syntetyzuje melaninę, która sekwestruje bakterie w miejscu infekcji. Odkładanie się pigmentu melaniny powoduje ogólnoustrojową melanizację, przyciemnienie koloru larw.

Hemocyty pochłaniają bakterie w fagosomy. Fagosomy łączą się z lizosomami, aby pozyskać enzymy lityczne, powodując degradację bakterii. Podgrupa bakterii może uniknąć degradacji fagolizosomalnej i przebywać w hemocytach - co prowadzi do uporczywej infekcji.

Mierz bioluminescencję bakterii w określonych odstępach czasu. Początkowy spadek bioluminescencji wskazuje na skuteczną odpowiedź przeciwbakteryjną, podczas gdy ustabilizowanie się wartości wskazuje na utrzymującą się infekcję.

Zakupione larwy w stadium rozwojowym należy przechowywać w ciemności w temperaturze 18 stopni Celsjusza po przybyciu i zużyć w ciągu tygodnia od zakupu. Zidentyfikuj i wybierz zdrowe larwy do eksperymentów w oparciu o jednolity kremowy kolor, odpowiednią wielkość i wagę, wysoką ruchliwość i zdolność do prostowania się po odwróceniu. Za pomocą pęsety z końcem ostrożnie policz zdrowe larwy na szalce Petriego wyłożonej warstwą bibuły filtracyjnej i przechowuj w temperaturze pokojowej w ciemności do momentu użycia.

Przygotować platformę iniekcyjną, przyklejając okrągłą bibułę filtracyjną o średnicy 94 milimetrów do płaskiej, podniesionej powierzchni. Odessać trzy objętości 70% etanolu do mikrostrzykawki o pojemności 25 mikrolitrów, aby wysterylizować, wyrzucić i dalej spłukać trzema objętościami sterylnego PBST. Następnie ponownie zawiesić przygotowane inokulum BCG lux i odessać 10 mikrolitrów do wysterylizowanej mikrostrzykawki. Użyć oddzielnej strzykawki do odessania PBST w celu kontroli ujemnej.

Po 10 wstrzyknięciach należy ponownie zawiesić inokulum BCG lux, aby zapewnić równomierne zawieszenie komórek. Za pomocą pęsety podnieś jedną larwę i umieść ją na platformie iniekcyjnej. Na platformie przewróć larwę na plecy i unieruchom, zabezpieczając głowę i ogon pęsetą. Zlokalizuj ostatnią lewą nogę odliczającą w dół od głowy larwy i ostrożnie włóż końcówkę igły na głębokość od 5 do 6 mm pod kątem 10 do 20 stopni do płaszczyzny poziomej. Wstrzyknąć inokulum ze strzykawki.

Po każdej infekcji przenieś zakażoną larwę na szalkę Petriego wyłożoną warstwą bibuły filtracyjnej. Pojedyncza 94-milimetrowa szalka Petriego może pomieścić do 30 larw. Przechowuj szalkę Petriego w wentylowanym ciemnym pudełku w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Monitoruj przeżywalność larw co 24 godziny. Larwy są uważane za martwe, gdy nie poruszają się w odpowiedzi na dotyk. Zapisz przeżycie i oceń istotność statystyczną za pomocą testu Mantela-Coxa.