JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:23 min. • July 8th, 2025
Aby zmierzyć obciążenie bakteryjne in vivo, zacznij od wysterylizowanych larw owadów wstępnie zakażonych Bacillus Calmette-Guérin lub BCG lux. BCG lux to genetycznie zmodyfikowany szczep Mycobacterium bovis BCG wykazujący ekspresję lucyferazy – enzymu wytwarzającego bioluminescencję.
Przenieś larwę owada do zawierającej bufor rurki z matrycą lizy za pomocą stalowych kulek. Za pomocą homogenizatora homogenizuj larwę, uwalniając składniki wewnątrzkomórkowe, w tym bakterie, do buforu.
Odwirować probówkę, aby zebrać homogenat i przenieść go do probówki z luminometrem.
Umyj probówkę matrycy buforem zawierającym detergent, aby rozpuścić fragmenty komórkowe i uwolnić resztki bakterii.
Połącz frakcje w tej samej probówce luminometru i dodaj substrat lucyferazy. Substraty wnikają w bakterie i wchodzą w interakcje z enzymami lucyferazy, powodując bioluminescencję. Załaduj rurkę do luminometru i zmierz bioluminescencję.
Luminometr mierzy natężenie emitowanego światła i oblicza względną jednostkę światła lub RLU — wskazującą na obciążenie in vivo BCG w larwie owada.
Rozcieńczoną zawiesinę homogenatu rozprowadzić na płytce agarowej zawierającej piperacylinę i inkubować w celu selektywnego wzrostu BCG jako odrębnych kolonii. Kolonie na płytce reprezentują jednostkę tworzącą kolonie lub CFU. Stosunek RLU do CFU koreluje bioluminescencję z żywotnością bakterii.
Co 24 godziny losowo wybierz pięć zainfekowanych larw i użyj wacika nasączonego 70% etanolem, aby delikatnie wysterylizować powierzchnię larw. Umieść larwy pojedynczo w dwumililitrowych probówkach z matrycą lizy zawierających 800 mikrolitrów sterylnego PBS. Następnie użyj homogenizatora, aby homogenizować larwy przez 60 sekund z prędkością sześciu metrów na sekundę.
Odwirować probówki do lizy z prędkością 3500 razy g przez pięć sekund, aby usunąć homogenat z pokrywek, a następnie ostrożnie zdekantować homogenat do pięciu sterylnych probówek luminometru pojedynczo. Zarezerwuj 100 mikrolitrów homogenatu w sterylnej 1,5-mililitrowej probówce reakcyjnej. Odzyskać pozostały homogenat przez przemycie probówek z matrycą lizy jednym mililitrem PBST i odpipetować do odpowiednich probówek z luminometrem.
Zwiruj rurki luminometru i zmierz bioluminescencję homogenatów na luminometrze. Następnie należy przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia zarezerwowanych 100 mikrolitrów homogenatu na 24-dołkowych płytkach hodowlanych przy użyciu PBST. Odpipetować 10 mikrolitrów rozcieńczenia na każdą płytkę agarową Middlebrook 7H11 i użyć sterylnego rozsiewacza do płytek. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa tygodnie.
Następnie policz jednostki tworzące kolonie.