JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:41 min • July 8th, 2025
Umieść znieczuloną mysz na sterylnej podkładce chirurgicznej przymocowanej do aparatu oddechowego z ciągłym przepływem tlenu i gazem znieczulającym.
Za pomocą filtra napełnić strzykawkę sterylnym powietrzem. Przymocuj igłę do strzykawki i wstrzyknij wysterylizowane powietrze podskórnie w tylną część myszy, aby utworzyć woreczek powietrzny w warstwach tkanki. Monitoruj mysz aż do odzyskania.
Ponownie znieczulij mysz i podaj lipopolisacharyd, LPS, do torebki powietrznej. LPS wiąże się z receptorem toll-podobnym 4, TLR-4 na makrofagach i komórkach dendrytycznych rezydujących w tkance, aktywując je.
Aktywowane komórki uwalniają różne mediatory stanu zapalnego, takie jak cytokiny i chemokiny, które przyciągają neutrofile i inne komórki odpornościowe. Mediatory te zwiększają również przepuszczalność naczyń krwionośnych w pobliżu naczyń krwionośnych, umożliwiając komórkom odpornościowym i rozpuszczalnym czynnikom przedostanie się do torebki powietrznej z krwiobiegu.
Gdy płyn gromadzi się w woreczku, tworzy wysięk składający się z komórek zapalnych i różnych bioaktywnych cząsteczek.
Poddaj mysz eutanazji i wstrzyknij odpowiedni bufor do płukania do woreczka powietrznego. Zebrać wysięk zapalny do probówki do mikrowirówki i odwirować. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze do przemywania wodą.
Przeanalizuj wysięk zapalny, aby określić ilościowo stosunek neutrofili i określić zakres ich naciekania.
Po znieczuleniu myszy w dniu zero użyj filtra 0,22 mikrona przymocowanego do pięciomililitrowej strzykawki, aby uzyskać trzymililitrową objętość wysterylizowanego powietrza. Podnieś tylną skórę znieczulonej myszy za pomocą pęsety i podskórnie użyj igły o wymiarach 26 na 3/8 cala, aby wstrzyknąć trzy mililitry wysterylizowanego powietrza.
Po leczeniu wyjmij myszy z aparatu oddechowego i umieść je w dobrze ustawionej klatce. Monitoruj myszy, aby upewnić się, że żyją, dopóki nie zaczną się poruszać. Trzeciego dnia wstrzyknij dodatkowe trzy mililitry wysterylizowanego powietrza do wcześniej utworzonej kieszeni powietrznej, aby podtrzymać worek powietrzny.
Szóstego dnia należy wstrzyknąć różne leki do torebki powietrznej. Wstrzyknąć jeden mililitr PBS jako kontrolę ujemną i wstrzyknąć jeden mililitr jednego mikrograma na mililitr LPS jako kontrolę pozytywną w celu wywołania miejscowego stanu zapalnego. Po sześciu godzinach poświęć myszy.
Do każdej torebki powietrznej wstrzyknij jeden mililitr buforu do płukania, aby umyć woreczek powietrzny i zbierz wysięk zapalny w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Następnie dwukrotnie przemyj woreczek powietrzny dwoma mililitrami buforu do przemywania i zbierz wysięk zapalny do tej samej probówki wirówkowej.
Wirować przy 100 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu do przemywania wody. Policz komórki, aby określić ilościowo stosunek neutrofili za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.