Kwantyfikacja naciekania komórek odpornościowych w uropatogennej tkance pęcherza myszy zakażonej E. coli za pomocą cytometrii przepływowej

0 views • 3:43 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby określić ilościowo infiltrację komórek odpornościowych w uropatogennej tkance pęcherza myszy zakażonej E. coli, należy umieścić zmieloną tkankę w buforze trawiennym zawierającym kolagenazę i dezoksyrybonukleazę.

Inkubować z regularnym potrząsaniem, aby rozbić tkankę.

Kolagenaza trawi macierz zewnątrzkomórkową tkanki, uwalniając komórki. Deoksyrybonukleaza rozkłada interferujące wolne DNA.

Po inkubacji dodać bufor ze środkiem chelatującym i płodową surowicę bydlęcą, aby dezaktywować enzymy trawienne.

Przepuszczoną mieszaninę przepuścić przez sitko w celu usunięcia resztek tkanki i tkanki łącznej, uzyskując zawiesinę jednokomórkową.

Odwirować i ponownie zawiesić komórki w buforze zawierającym przeciwciała blokujące Fc. Przeciwciała te wiążą się z receptorami Fc komórek odpornościowych, aby zapobiec wiązaniu przeciwciał nieswoistych.

Dodaj znakowane fluoroforem przeciwciała anty-CD45, które wiążą się z transbłonowym białkiem CD45 na komórkach odpornościowych.

Odwirować i przepuścić zawieszone komórki przez sitko komórkowe w celu usunięcia agregatów komórkowych.

Za pomocą cytometru przepływowego zmierz sygnały fluorescencyjne z przeciwciał sprzężonych z fluoroforem na komórkach odpornościowych, aby określić ilościowo infiltrację komórek odpornościowych w pęcherzu moczowym.

Aby przeprowadzić cytometrię przepływową na tkance pęcherza moczowego, po odizolowaniu pęcherza, jak pokazano, użyj nożyczek, aby dobrze zmielić tkankę. Dodać 1 zmielony pęcherz do probówki zawierającej bufor wytrawiający, a następnie wstrząsnąć probówką, aby umyć zmieloną tkankę w buforze do wytrawiania i trzymać ją na lodzie, aż wszystkie pęcherze zostaną wycięte i zmielone. Inkubować rozdrobnione pęcherze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 do 75 minut, energicznie potrząsając ręką przez 5 sekund co 15 minut.

Kiedy tkanka ma szklisty, przezroczysty wygląd przypominający mokrą bibułkę, trawienie jest zakończone. Dezaktywuj enzymy wytrawiania, dodając od 2 do 3 mililitrów lodowatego buforu cytometrii przepływowej i delikatnie wymieszaj. Następnie umieść rurki na lodzie.

Aby zapewnić zawiesinę jednokomórkową i usunąć tkankę łączną, przepuść zawartość probówki przez filtr o średnicy 100 mikrometrów umieszczony w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Następnie, za pomocą końcówki tłoka strzykawki, delikatnie przeciśnij pozostałą tkankę przez filtr. Umyj filtr dodatkowymi 2 mililitrami buforu do cytometrii przepływowej i utrzymuj próbki na lodzie. Następnie umyj próbki przez odwirowanie w temperaturze 200 razy g w 4 stopniach Celsjusza przez 7 minut.

Zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu cytometrii przepływowej zawierającego blok Fc rozcieńczony do 5 mikrogramów na mililitr i przenieść na 96-dołkową płytkę okrągłodenną. Po 10 do 15 minutach dodaj 100 mikrolitrów pożądanego koktajlu przeciwciał do każdej próbki. Następnie próbki należy inkubować na lodzie, chronionym przed światłem, przez 30 do 45 minut. Próbki przemywać przez odwirowanie 200 razy g w 4 stopniach Celsjusza przez 7 minut.

Na koniec ponownie zawieś granulki komórek w 200 mikrolitrach bufora cytometrii przepływowej i przepuść próbki przez 40-mikrometrowe sitko komórkowe na 5-mililitrowej rurki polistyrenowej tuż przed pobraniem na cytometrze przepływowym.

10:19

Mysi model kolonizacji pochwy paciorkowcami grupy B

Related Videos

0 Views

04:01

Procedura wkraplania przezcewkowego u dorosłego samca myszy

Related Videos

0 Views

07:34

Izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek

Related Videos

0 Views

09:24

Przezcewkowa indukcja zakażenia dróg moczowych myszy

Related Videos

0 Views

05:23

Przygotowanie tkanek pęcherza myszy do wizualizacji infekcji bakteryjnej

Related Videos

0 Views

02:06

Wizualizacja społeczności bakteryjnych wewnątrzkomórkowych w zakażonym pęcherzu myszy

Related Videos

0 Views

02:32

Cewnikowanie przezcewkowe i inokulacja bakteryjna w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u samców myszy

Related Videos

0 Views

11:20

Ilościowa ocena migracji neutrofili człowieka przez nabłonek pęcherza moczowego z hodowlą

Related Videos

0 Views

08:40

Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim

Related Videos

0 Views

10:23

Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026