Opracowanie modelu hodowli komórkowej in vitro dla jednoczesnego zakażenia malarią i HIV

Rozpocząć od płytki wielodołkowej zawierającej ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC pochodzące od ludzkiego wirusa niedoboru odporności lub dawcy zakażonego wirusem HIV.

PBMC zawierają różne komórki odpornościowe, w tym zakażone wirusem HIV limfocyty T CD4-dodatnie ze zintegrowanym prowirusowym DNA.

Zasiej studzienki mieszaniną erytrocytów pasożytniczych Plasmodium falciparum lub PfRBC - eksprymujących antygeny pochodzące od pasożytów i niezakażonych erytrocytów.

Podczas inkubacji antygeny PfRBC oddziałują z receptorami komórek odpornościowych, aktywując je i uwalniając cytokiny.

Cytokiny te wyzwalają dalszą sygnalizację w limfocytach T CD4, inicjując transkrypcję DNA prowirusa HIV i syntezę nowych wirusowych RNA.

Wirusowe RNA i białka HIV tworzą cząsteczki wirusa, które pączkują, infekując nowe limfocyty T CD4 i rozprzestrzeniając zakażenie wirusem HIV.

Postępujące zakażenie wirusem HIV zaburza wydzielanie cytokin, upośledzając odpowiedź immunologiczną przeciwko PfRBC i prowadząc do trwałego zakażenia malarią.

Z biegiem czasu zakażone erytrocyty uwalniają pasożyty, które atakują nowe erytrocyty, namnażając pasożyty malarii i ustanawiając model hodowli komórkowej jednoczesnej infekcji malarią i HIV.

Aby skonfigurować kultury koinfekcji, zacznij od wysiewu 1 x 10⁶ świeżo wyizolowanych PBMC z HIV i HIV-ujemnych w 100 mikrolitrach RPMI-S + na studzienkę do 24-dołkowej płytki. Podnieś całkowitą objętość każdego dołka do 500 mikrolitrów za pomocą 400 mikrolitrów RPMI-S+.

Następnie, trzykrotnie i w całkowitej objętości 500 mikrolitrów na studzienkę, dodać 3 x 10⁶ niezakażonych krwinek czerwonych lub 3 x 10⁶ spasożytowanych krwinek czerwonych do komórek zakażonych wirusem HIV i niezakażonych wirusem HIV. Umieścić płytkę do jednoczesnego zakażenia w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Następnie, po odpowiednim okresie doświadczalnym, zagnieździć komórki i zebrać 700 mikrolitrów supernatantu hodowlanego z każdej studzienki. Odwirować supernatant w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń. Następnie, w stosownych przypadkach, należy podzielić próbki na porcje; Oznacz probówki i zamroź je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub niższej do późniejszej analizy.