JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 2:33 min • July 8th, 2025
Weźmy hodowlę organoidów jelitowych człowieka. Organoidy składają się z komórek nabłonka skierowanych w stronę centralnego światła, naśladujących architekturę in vivo.
Weźmy mikrowstrzykiwacz zawierający sporozoity w kształcie półksiężyca – formę zakaźną – pasożyta Cryptosporidium parvum.
Wstrzyknąć sporozoity do światła organoidu.
Lektyny pasożytów wiążą się ze specyficznymi węglowodanami na komórkach nabłonka, ułatwiając ich wejście do parazytoforycznej wakuoli.
Zinternalizowany pasożyt przekształca się w trofozoit – etap żerowania – który pozyskuje składniki odżywcze i ulega rozmnażaniu bezpłciowemu, tworząc meront typu I, zawierający merozoity – formę inwazyjną.
Uwolnione merozoity infekują sąsiednie komórki nabłonkowe i rozwijają meronty typu II zawierające merozoity.
Merozoity wnikają do sąsiednich komórek i różnicują się w microgamont lub macrogamont - męskie i żeńskie stadia rozrodcze.
Microgamont ulega podziałowi, tworząc mikrogamety, które są uwalniane na zewnątrz wakuoli.
Mikrogameta zapładnia makrogamont, wytwarzając zygotę.
Zygota ulega podziałowi, tworząc oocystę zawierającą sporozoit. Po uwolnieniu sporozoity powtarzają cykl infekcji.
Zbierz organoidy, aby ocenić postęp infekcji.
Aby wprowadzić mikroiniekcję pasożytów do wierzchołkowej strony organoidu 3D, najpierw użyj ściągacza do mikropipet, aby przygotować szklane kapilary iniekcyjne. Użyj kleszczyków, aby przyciąć końcówkę kapilary do średnicy od 9 do 12 mikrometrów, aby umożliwić łatwy przepływ sporozoitów lub oocyst, jeśli zdecydujesz się na bezpośrednie wstrzyknięcie oocyst, i użyj końcówek mikroładowacza, aby wypełnić każdą kapilarę szybką zawiesiną oocysty lub sporozoitu znakowaną zielonym barwnikiem.
Następnie załaduj pierwszą kapilę wypełnioną sporozoitem do mikrowstrzykiwacza i użyj odwróconego mikroskopu przy 5-krotnym powiększeniu i stałym ciśnieniu, aby wprowadzić mikroiniekcję od 100 do 200 nanolitrów zawiesiny do każdego organoidu.