JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:37 min. • July 8th, 2025
Podczas infekcji makrofagi pęcherzykowe uwalniają zewnątrzkomórkowe pułapki makrofagów lub MET w celu wyeliminowania patogenów.
MET składają się z włókien chromatyny skompleksowanych z deiminazami peptydyloargininy, PAD, metaloproteinazami macierzy i cytrulinowanymi histonami.
Aby uwidocznić MET w makrofagach z płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, najpierw odwiruj płyn.
Zawiesiny zawiesin należy umieścić na szkiełkach nakrywkowych w studzienkach płytkowych z wieloma dołkami.
Makrofagi przyczepiają się do szkiełek nakrywkowych, podczas gdy inne komórki pozostają zawieszone i są odrzucane.
Napraw makrofagi, zachowując strukturę komórkową. Przepuszczalność ich, aby uzyskać dostęp do celów komórkowych.
Dodaj białka blokujące, zapobiegając niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.
Suplement z pierwszorzędowym koktajlem przeciwciał, który wiąże się odpowiednio z docelowymi cytrulinowanymi histonami, PAD i metaloproteinazami macierzy.
Dodaj różne przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem, które wiążą się z docelowymi przeciwciałami pierwszorzędowymi związanymi z białkiem MET.
Zamontuj ogniwa za pomocą podłoża montażowego zawierającego DAPI. DAPI, barwnik fluorescencyjny, barwi włókna chromatyny.
Za pomocą mikroskopu konfokalnego wizualizuj MET charakteryzujące się fluorescencyjnymi włóknami chromatyny zewnątrzkomórkowej z cytrulinowanymi histonami, PAD i metaloproteinazami.
Po uzyskaniu makrofagów płucnych od ludzi i myszy za pomocą płukania oskrzelowo-pęcherzykowego lub BAL, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj błękitu trypanowego i hemocytometru, aby wykonać żywotną liczbę komórek w roztworze BAL. Odpipetować od 1 do 4 x 105 makrofagów w 500 mikrolitrach pożywki hodowlanej na szkiełka nakrywkowe w dołkach na płytkach 24-dołkowych. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby komórki przylegały.
Usuń pożywkę hodowlaną i użyj PBS do jednokrotnego umycia komórek. Następnie dodaj 2% paraformaldehydu/periodianu/lizyny lub utrwalacza PLP i inkubuj próbki przez 10 minut. Po użyciu PBS do krótkiego umycia komórek, dodaj 0,2% Tween-20 do PBS i inkubuj komórki przez 20 minut.
Następnie, aby zablokować komórki, dodaj 10% surowicy kurczaka do 5% BSA rozcieńczonego w PBS i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie zastąp roztwór blokowy stężeniem od 1 do 100 pierwszorzędowych i izotopowych przeciwciał kontrolnych i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po inkubacji należy użyć PBS do przemycia komórek przed dodaniem odpowiednich przeciwciał drugorzędowych. Następnie inkubować próbki przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
Po umyciu komórek w PBS zamontuj próbki za pomocą podłoża montażowego na bazie DAPI. Następnie zwizualizuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego.