System reporterowy rekombinowanego wirusa in vitro do wykrywania infekcji wirusowych

Weźmy na przykład hodowlę ludzkich komórek raka wątroby, genetycznie zmodyfikowaną w celu ekspresji polipeptydu kotransportującego taurocholan sodu lub NTCP - receptora transbłonowego.

Dodać rekombinowany wirus zapalenia wątroby typu B lub HBV. Wirus składa się z zewnętrznej otoczki zawierającej białka powierzchniowe i wewnętrznego nukleokapsydu otaczającego genom. Wprowadzenie genu reporterowego lucyferazy hamuje zdolność reprodukcyjną wirusa.

Białko otoczki wirusa wiąże się z receptorem NTCP komórki gospodarza.

NTCP oddziałuje z receptorem naskórkowego czynnika wzrostu, EGFR, i oligomeryzuje, indukując endocytozę wirusa za pośrednictwem EGFR.

Otoczka wirusowa łączy się z błoną endosomu, aby uwolnić nukleokapsyd, który rozpada się w kompleksie porów jądrowych.

Genom wirusa dostaje się do jądra i przekształca się w kowalencyjnie zamknięty kolisty DNA lub cccDNA - stabilną matrycę - kodującą białka wirusa, w tym lucyferazę.

W określonych odstępach czasu zbieraj komórki i poddawaj lizie, aby uwolnić wewnątrzkomórkową lucyferazę.

Wprowadź podłoże reporterowe. Lucyferazy utlenia substrat, wytwarzając sygnał.

Wzrost aktywności lucyferazy po zakażeniu wskazuje na ciągłą ekspresję genomu wirusa.

Płytki Komórki HepG2, stabilnie eksprymujące taurocholan sodu, polipeptyd kotransportujący lub NTCP, które są podatne na zakażenie HBV, i inkubują w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Na dzień przed zakażeniem umieść około 5 x 10⁴ komórek HepG2 / NTCP w dołkach 96-dołkowej płytki pokrytej kolagenem w 0,1 mililitra pożywki hodowlanej. Rozmrażać rekombinowany wirus HPV w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż w fiolce pozostanie niewielka ilość lodu.

Przygotuj pożywkę do infekcji, łącząc 78 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej, dwa mikrolitry DMSO, 10 mikrolitrów 40% PEG8000 w 1X PBS i 10 mikrolitrów rekombinowanego HPV. Dodaj 100 mikrolitrów rekombinowanego roztworu HBV do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.

Jednego dnia po zakażeniu użyj 300 mikrolitrów PBS do trzykrotnego przemycia komórki, aby usunąć zanieczyszczające białko reporterowe z frakcji wirusa. Dodać 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej zawierającej 2% DMSO do zakażonych komórek i inkubować przez tydzień lub krócej.

Aby przeprowadzić analizę zakażenia HBV, tydzień po zakażeniu należy użyć PBS do trzykrotnego przemycia zakażonych komórek. Dodaj 50 mikrolitrów buforu do lizy do zainfekowanych komórek. Kołysz płytką hodowlaną przez pięć minut, a następnie odwiruj w temperaturze 2000 razy g przez pięć minut. Dodaj 50 mikrolitrów substratu reporterowego do płytki luminometru, a następnie dodaj 20 mikrolitrów lizatu komórkowego do płytki i wymieszaj przez krótkie wstrząsanie. Na koniec umieść płytkę w luminometrze i rozpocznij odczyt.