System reporterowy rekombinowanego wirusa in vitro do wykrywania infekcji wirusowych
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:56 min • July 8th, 2025
Weźmy na przykład hodowlę ludzkich komórek raka wątroby, genetycznie zmodyfikowaną w celu ekspresji polipeptydu kotransportującego taurocholan sodu lub NTCP - receptora transbłonowego.
Dodać rekombinowany wirus zapalenia wątroby typu B lub HBV. Wirus składa się z zewnętrznej otoczki zawierającej białka powierzchniowe i wewnętrznego nukleokapsydu otaczającego genom. Wprowadzenie genu reporterowego lucyferazy hamuje zdolność reprodukcyjną wirusa.
Białko otoczki wirusa wiąże się z receptorem NTCP komórki gospodarza.
NTCP oddziałuje z receptorem naskórkowego czynnika wzrostu, EGFR, i oligomeryzuje, indukując endocytozę wirusa za pośrednictwem EGFR.
Otoczka wirusowa łączy się z błoną endosomu, aby uwolnić nukleokapsyd, który rozpada się w kompleksie porów jądrowych.
Genom wirusa dostaje się do jądra i przekształca się w kowalencyjnie zamknięty kolisty DNA lub cccDNA - stabilną matrycę - kodującą białka wirusa, w tym lucyferazę.
W określonych odstępach czasu zbieraj komórki i poddawaj lizie, aby uwolnić wewnątrzkomórkową lucyferazę.
Wprowadź podłoże reporterowe. Lucyferazy utlenia substrat, wytwarzając sygnał.
Wzrost aktywności lucyferazy po zakażeniu wskazuje na ciągłą ekspresję genomu wirusa.
Płytki Komórki HepG2, stabilnie eksprymujące taurocholan sodu, polipeptyd kotransportujący lub NTCP, które są podatne na zakażenie HBV, i inkubują w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.
Na dzień przed zakażeniem umieść około 5 x 104 komórek HepG2 / NTCP w dołkach 96-dołkowej płytki pokrytej kolagenem w 0,1 mililitra pożywki hodowlanej. Rozmrażać rekombinowany wirus HPV w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż w fiolce pozostanie niewielka ilość lodu.
Przygotuj pożywkę do infekcji, łącząc 78 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej, dwa mikrolitry DMSO, 10 mikrolitrów 40% PEG8000 w 1X PBS i 10 mikrolitrów rekombinowanego HPV. Dodaj 100 mikrolitrów rekombinowanego roztworu HBV do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.
Jednego dnia po zakażeniu użyj 300 mikrolitrów PBS do trzykrotnego przemycia komórki, aby usunąć zanieczyszczające białko reporterowe z frakcji wirusa. Dodać 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej zawierającej 2% DMSO do zakażonych komórek i inkubować przez tydzień lub krócej.
Aby przeprowadzić analizę zakażenia HBV, tydzień po zakażeniu należy użyć PBS do trzykrotnego przemycia zakażonych komórek. Dodaj 50 mikrolitrów buforu do lizy do zainfekowanych komórek. Kołysz płytką hodowlaną przez pięć minut, a następnie odwiruj w temperaturze 2000 razy g przez pięć minut. Dodaj 50 mikrolitrów substratu reporterowego do płytki luminometru, a następnie dodaj 20 mikrolitrów lizatu komórkowego do płytki i wymieszaj przez krótkie wstrząsanie. Na koniec umieść płytkę w luminometrze i rozpocznij odczyt.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje mechanizm infekcji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) w komórkach raka wątroby człowieka, które zostały zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji polipeptydu współtransportującego taurocholian sodu (NTCP). Badania podkreślają rolę NTCP w ułatwianiu wniknięcia HBV oraz późniejszej ekspresji białek wirusowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Biologia komórki
- Onkologia
Wstęp
- Wirus zapalenia wątroby B stanowi istotny problem w skali światowego zdrowia publicznego.
- NTCP jest receptorem pośredniczącym w wnikaniu HBV do komórek wątroby.
- Zrozumienie mechanizmów infekcji HBV może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Testy reporterowe z lucyferazą są wykorzystywane do pomiaru aktywności wirusa.
Cel badania
- Wyjaśnienie roli NTCP w infekcji HBV.
- Ocena ekspresji genomu wirusowego po infekcji.
- Opracowanie niezawodnej metody badania HBV in vitro.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek HepG2 wykazujących ekspresję NTCP.
- Zakażenie rekombinowanym HBV zawierającym gen reporterowy lucyferazy.
- Lizy komórek i pomiar aktywności lucyferazy.
- Zastosowanie PBS i buforu do lizy podczas przetwarzania komórek.
Główne wyniki
- Skuteczne zakażenie komórek HepG2/NTCP przez HBV.
- Zwiększona aktywność lucyferazy wskazuje na trwałą ekspresję genomu wirusa.
- Interakcja NTCP z HBV ułatwia wniknięcie wirusa do komórek gospodarza.
- Testy lucyferazy zapewniają ilościowy pomiar zakażenia HBV.
Wnioski
- NTCP jest niezbędny dla wniknięcia HBV do komórek wątroby.
- Testy reporterowe lucyferazy są skuteczne w badaniu dynamiki HBV.
- Model ten może być wykorzystany w przyszłych badaniach nad HBV i testowaniu leków.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe wykrywanie infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) przy użyciu rekombinowanego systemu reporterowego lucyferazy umożliwia precyzyjny pomiar wczesnych zdarzeń związanych z wnikaniem wirusa i jego replikacją w ludzkich komórkach wątroby. Możliwość ta zwiększa wiarygodność przewidywań w zakresie walidacji celu oraz redukcji ryzyka mechanistycznego w procesach poszukiwania nowych leków przeciwwirusowych. System ten stanowi skalowalną i powtarzalną platformę do oceny oddziaływań HBV z gospodarzem oraz przesiewowego badania potencjalnych interwencji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów wnikania HBV poprzez angażowanie receptora NTCP.
- Wspiera walidację funkcjonalną oddziaływań gospodarz-wirus, kluczową dla celowania terapeutycznego.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez oddzielenie wczesnych zdarzeń infekcyjnych od późniejszej replikacji.
- Zapewnia ilościowe odczyty służące do priorytetyzacji celów w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zwalidowany, powtarzalny test komórkowy do wykrywania infekcji HBV.
- Generuje silne, ilościowe sygnały lucyferazy, odpowiednie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
- Standaryzuje pomiar infekcji, umożliwiając wiarygodną ocenę związków oraz przenoszalność testu.
- Wspiera skalowalność w badaniach przesiewowych bibliotek ukierunkowanych na wniknięcie lub replikację wirusa.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia dynamikę infekcji in vitro z modelami komórek gospodarza istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość przejścia od odkryć mechanistycznych do przedklinicznej walidacji kandydatów na leki przeciwwirusowe.
- Stanowi platformę do oceny translacyjnych biomarkerów infekcji HBV przy zastosowaniu dodatkowych punktów końcowych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez wyjaśnienie wczesnych interakcji wirus-gospodarz.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten rekombinowany system wirusowy reporterowy integruje się na styku wczesnego etapu odkrywania i identyfikacji wiodących związków, wspierając zarówno badania mechanistyczne, jak i procesy przesiewowe w badaniach nad HBV.
- Biologia odkrywcza: Ilościowo określa wnikanie wirusa oraz wczesną replikację, wyjaśniając szlaki infekcji zapśredniczone przez NTCP.
- Przesiewy: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne odczyty oparte na lucyferazie do oceny związków.
- Analityka: Umożliwia czuły, ilościowy pomiar kinetyki infekcji oraz porównywanie warunków.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie infekcji w komórkach pochodzenia z ludzkiej wątroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, adaptowalną platformę dla różnorodnych potrzeb badawczych nad HBV oraz przesiewów przeciwwirusowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz w zrozumieniu mechanizmów infekcji HBV.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów dla zespołów B+R.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach w portfelach leków przeciwwirusowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów skierowanych przeciwko HBV oraz rozwój kandydatów na leki w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórkowych, pracy z wirusami oraz testów opartych na luminescencji.
- Konieczny jest dostęp do komórek HepG2 wykazujących ekspresję NTCP oraz rekombinowanego wirusa HBV z genem reporterowym.
- Wymagane jest ustandaryzowane oprzyrządowanie do detekcji sygnału lucyferazy i analizy danych.
- W celu zapewnienia powtarzalności niezbędne jest uzgodnienie protokołów testowych i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych systemów wirusowych może wymagać dodatkowej walidacji i optymalizacji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Lucyferazy-fluorescencyjny wirus reporterowy grypy do obrazowania na żywo i ilościowego oznaczania infekcji wirusowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wysokoprzepustowe testy przeciwwirusowe do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów replikacji wirusa Zika
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wirus wirusa grypy reporterowej lucyferazy-fluorescencji do śledzenia infekcji wirusowych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Opracowanie systemu zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B w celu monitorowania wczesnych etapów cyklu replikacji
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Obrazowanie żywych komórek szlaku sygnałowego TGF-β/Smad3 in vitro i in vivo przy użyciu systemu reporterowego adenowirusa
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026