Przeszczep komórek śródrdzeniowych w celu ukierunkowania na róg brzuszny szyjki macicy w stwardnieniu zanikowym bocznym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego

Przeszczep prekursorów nerwowych jest obiecującą strategią ochrony i/lub zastąpienia utraconych/dysfunkcyjnych neuronów ruchowych szyjki macicy w urazie rdzenia kręgowego (SCI) i zaburzeniu neuronu ruchowego, stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS). Zapewniamy protokół dostarczania komórek do rogu brzusznego rdzenia kręgowego szyjnego w modelach gryzoni ALS i SCI.

Ogólnym celem tej procedury jest ukierunkowanie na wielosegmentowe, śródrdzeniowe przeszczepienie nerwowych komórek prekursorowych do rdzenia kręgowego szyjnego, brzusznej istoty szarej zarówno szczurów, jak i myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie do przeszczepu neuronalnej komórki prekursorowej, która jest przedmiotem zainteresowania. Następnie wykonuje się laminektomię rdzenia kręgowego w każdym punkcie planowanego przeszczepu komórek.

Następnie komórki są odpowiednio wstrzykiwane w odpowiednie miejsca i głębokości, aby dokładnie ukierunkować dostarczanie komórek do brzusznego rogu szyjnego rdzenia kręgowego. Ostatnim krokiem jest kontynuowanie podawania zwierzęciu supresji immunologicznej aż do złożenia ofiary, aby osiągnąć przeżycie przeszczepionych komórek w rdzeniu kręgowym. Ostatecznie można uzyskać wyniki śledzenia przeżycia, migracji i różnicowania przeszczepionych nerwowych komórek prekursorowych w dorosłym rdzeniu kręgowym szyjki macicy w różnych punktach czasowych po przeszczepie za pomocą metod histologicznych, takich jak immunohistochemia, a następnie analiza mikroskopowa.

Demonstracja wizualna w tej metodzie ma kluczowe znaczenie, ponieważ wiele skomplikowanych etapów chirurgii rdzenia kręgowego i przeszczepu komórek jest trudnych do nauczenia, ponieważ wymagają dużej staranności i specjalnych technik, a są łatwiejsze. Jeśli te zalecane procedury są stosowane Trzy dni przed przeszczepieniem należy immunosupresję zwierzęcia, podając codzienne zastrzyki po 10 miligramów na kilogram masy ciała, cyklosporyny A we wstrzyknięciu podskórnym. Jeśli mają zostać przeszczepione komórki pochodzące od gryzoni lub jeden miligram na kilogram masy ciała zarówno FK 5 0 6, jak i rapamycyny we wstrzyknięciu dootrzewnowym.

Jeśli mają zostać przeszczepione komórki pochodzące od człowieka, kształtuje również solidne spinacze do papieru, tworząc retraktory. Oderwij część spinacza, aby zrobić haczyk, a drugi koniec spinacza zegnij w małą pętlę. Następnie przewiąż sznurek przez pętlę każdego retraktora, autoklawu, retraktorów i wszystkich narzędzi, które mają być używane podczas operacji w dniu operacji.

Przygotować podwielokrotności komórek progenitorowych gleju lub innych komórek do przeszczepu zgodnie z procedurami opisanymi w pisemnym protokole. Po zebraniu komórek rozprowadź zawiesiny komórek między wieloma 1,5-mililitrowymi mikroprobówkami wirówkowymi i trzymaj na mokrym lodzie. Następnie, po podaniu zwierzęciu odpowiedniej metody znieczulenia, należy potwierdzić, że uzyskano odpowiednie znieczulenie do zabiegu chirurgicznego, wykonując uszczypnięcie palca u nogi.

Używając elektrycznej maszynki do golenia grzbietu zwierzęcia, włosy od obszaru lekko rostralnego do uszu do środka grzbietu zwierzęcia dobrze się golą i usuwaj ścięte włosy ze skóry, aby zapobiec dostaniu się włosów do nacięcia. Następnie namocz kawałek gazy w roztworze antyseptycznym jodu powidonu i nałóż na skórę na ogolony obszar. Wyszoruj co najmniej dwa razy roztworem antyseptycznym i dwa razy alkoholem lub rozcieńczonym środkiem dezynfekującym w okrężny sposób.

Zaczynając od miejsca nacięcia, kierując się na zewnątrz w kierunku linii włosów. Umieść sterylnie zwinięty gazik na czystej tablicy operacyjnej i przyklej go do deski, aby się nie poruszał. Umieść zwierzę na zwiniętej gazie w pozycji suszonej śliwki.

Rozciągnij obie ręce zwierzęcia na podkładce, a następnie przyklej ramiona do podkładki i deski chirurgicznej, aby podeprzeć rdzeń kręgowy w odcinku szyjnym. Ułatwi to pracę podczas całego zabiegu, ponieważ rdzeń szyjny znajduje się głęboko pod powierzchnią skóry. Podczas tego zabiegu należy użyć sterylnej serwety chirurgicznej, chociaż nie jest to pokazane na filmie w celach demonstracyjnych.

Najpierw, patrząc przez mikroskop chirurgiczny ustawiony na najmniejsze powiększenie, za pomocą ostrego sterylnego skalpela wykonaj nacięcie w linii środkowej od podstawy czaszki do łopatki. Następnie wykonaj nacięcie przez trzy warstwy mięśni nad kręgosłupem. Użyj wystarczającego nacisku, aby przeciąć wszystkie warstwy mięśni przy minimalnej liczbie nacięć, ale nie naciskaj zbyt mocno, ponieważ może to spowodować uszkodzenie głębszych tkanek za pomocą dwóch aplikatorów z bawełnianą końcówką.

Użyj ruchu skręcającego, aby oddzielić mięsień leżący nad nim od mięśnia przykręgosłupowego. Nie przecinaj ani nie rozrywaj mięśni, ponieważ spowoduje to krwotok. Umieść cztery domowe zwijacze w pozycji, aby cofnąć mięsień.

Następnie pociągnij każdy z czterech zwijaczy do wszystkich czterech rogów i przyklej sznurki do deski, aby zabezpieczyć zwijacz. Ostateczna ekspozycja powinna mieć kształt kwadratu lub prostokąta. Użyj kleszczyków zębatych dla szczurów i średniej wielkości nożyczek sprężynowych, aby usunąć mięsień przykręgosłupowy z grzbietowej powierzchni kręgów.

Wykonuj nacięcia bardzo blisko kości, aby lepiej wyeksponować powierzchnię kości. Upewnij się, że nacięcia są równoległe do powierzchni kręgów, ale nie wcinaj się w pępowinę. Zamień średniej wielkości nożyczki sprężynowe na surowy lemiesz.

Następnie zabezpiecz całą kolumnę kręgosłupa, chwytając mięsień nad procesem C dwa za pomocą kleszczy do zębów szczura i użyj surowego she, aby odciągnąć mięsień na poziomie C cztery, C pięć i C sześć. Następnie rozpocznij laminektomię w wieku pięciu lat. Ponownie zabezpiecz obszar, przytrzymując C dwa za pomocą kleszczy zębatych szczurów.

Chwyć całą blaszkę za pomocą surowego ona i ustaw surową część tak, aby narzędzie było całkowicie prostopadłe do osi kręgosłupa. Powoli i delikatnie zmiażdż blaszkę, nie wciskając się do rdzenia kręgowego. Następnie delikatnie pociągnij złamany kawałek kości do góry.

Następnie ustaw surowy ger prostopadle do kręgosłupa. Następnie delikatnie włóż surowy ger pod kość pod kątem od 30 do 60 stopni w stosunku do powierzchni sznurka. Wykonaj małe nacięcia, aby rozszerzyć laminektomię na wszystkie C, cztery do C, sześć lat.

Nie należy rozciągać laminektomii zbyt daleko na boki, ponieważ spowoduje to krwotok. Zwiększ powiększenie mikroskopu do około 15 x i skup się na przewodzie. Użyj prostego, ostrego.

Numer pięć kleszczy do czyszczenia tkanki łącznej na wierzchu opony twardej. Następnie użyj mini nożyczek sprężynujących lub mikronoża, aby naciąć oponę twardą równolegle do osi kręgosłupa. Jako punkt tuż przyśrodkowy do strefy wejścia korzonków grzbietowych, należy upewnić się, że opona twarda jest przebita w miejscu wstrzyknięcia.

Po przekłuciu płyn mózgowo-rdzeniowy opony twardej wyleje się na sucho z powierzchni pępowiny i całej ekspozycji za pomocą gazy lub aplikatora z bawełnianą końcówką. Użyj kleszczy, aby chwycić i lekko podnieść oponę twardą z dala od rdzenia kręgowego, nie ściskając ani nie uszkadzając rdzenia kręgowego. Nieznacznie przedłuż nacięcie w osi rostralnej rdzenia za pomocą 10-mikrolitrowej strzykawki z wyjmowaną igłą typu Hamiltona.

Wyposażony w ostrą metalową igłę Hamiltona o rozmiarze 33 i kąsie 45 stopni. Powoli należy wprowadzić wymaganą objętość zawiesiny komórkowej na jedno miejsce wstrzyknięcia. Opuść końcówkę igły w kierunku powierzchni grzbietowej rdzenia kręgowego, jednocześnie monitorując jej postęp pod mikroskopem.

Ustaw strzykawkę w jednej linii z osią kręgosłupa, aby prawidłowo wycelować w pożądany obszar anatomiczny, kierując igłę jak najbliżej 90 stopni i tylko przyśrodkowo do strefy wejścia korzonków grzbietowych. Delikatnie dotknąć powierzchni rdzenia kręgowego końcówką igły, lekko dociskając rdzeń kręgowy końcówką igły. Następnie należy cofnąć igłę, aż rdzeń kręgowy powróci do normalnej pozycji.

Zapisz tę pozycję, ponieważ Z jest równe 0,0 za pomocą linijki na mikromanipulatorze. Następnie, monitorując wzrokowo postęp przez mikroskop, lekko opuść igłę do rdzenia kręgowego. Obniż igłę, aby dostosować 1,5 milimetra do celowania w róg brzuszny u dorosłego szczura.

Pozostawić igłę na miejscu na dwie do pięciu minut przed rozpoczęciem wstrzyknięcia. Upewnij się, że w tym czasie konfiguracja chirurgiczna pozostaje niezakłócona. Następnie wstrzyknąć dwa mikrolitry komórek przez dwie do pięciu minut ze stałą szybkością za pomocą sterownika pompy po wstrzyknięciu, pozostawić igłę na miejscu na dwie do pięciu minut.

Następnie ostrożnie wyjmij igłę z rdzenia kręgowego. Powtórzyć proces wstrzykiwania dla innych miejsc docelowych. Po wstrzyknięciu wszystkich miejsc docelowych przywróć mikroskop do najmniejszego powiększenia i zszyj.

Zamknął wszystkie trzy leżące nad nim warstwy mięśni jednocześnie czterema mięśniami szwu zerowego w trzech miejscach osi rostralnej kordala. Zszyj skórę za pomocą dziewięciomilimetrowych spinek, upewniając się, że zszywki są oddalone od siebie o około 0.5 centymetra. Dokręć zszywki za pomocą uchwytów na igły, aby zwierzę nie oderwało zszywek przed pełnym zagojeniem się rany.

Nałóż roztwór antyseptyczny powidonu IRD na obszar rany ciętej za pomocą nasączonej gazy i pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu na krążącej ciepłej wodzie. Kontynuuj wstrzykiwanie cyklosporyny A lub FK 5 0 6 rapamycyny dziennie, aż do przybycia ofiary 50 000 myszy. Komórki progenitorowe gleju przeszczepiono do brzusznego rogu rdzenia kręgowego poziomu C cztery, u szczura SOD jeden G 93.

Ten obraz pokazuje, że przybyła mysz z dodatnim wynikiem M, przeszczepione komórki przeżyły miesiąc po przeszczepie, a komórki zlokalizowały się w brzusznej istocie szarej, ale miejsce wstrzyknięcia przyśrodkowo ominęło boczny róg brzuszny, jak oznaczono linią przerywaną. Jak widać tutaj, wstrzyknięcie znacznie większej liczby komórek do tego obszaru powoduje uszkodzenie w miejscu wstrzyknięcia i wzdłuż ścieżki igły. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około 45 do 60 minut w sześciu miejscach wstrzyknięcia, jeśli jest wykonywana prawidłowo.