Name: Przeszczep komórek śródrdzeniowych w celu ukierunkowania na róg brzuszny szyjki macicy w stwardnieniu zanikowym bocznym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu komórek śródrdzeniowych do rogu brzusznego rdzenia szyjnego u szczurów i myszy w modelach stwardnienia zanikowego bocznego oraz urazowego uszkodzenia rdzenia kręgowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chciałbym podziękować: wszystkim członkom laboratoriów Lepore, Maragakis i Rothsteina za pomocne dyskusje; organizacji Paralyzed Veterans of America oraz fundacji Craig H. Neilsen za sfinansowanie badań.

<ol><li>Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).</li>
<li>Kaplan, L. M., Hollander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dysfunction+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chest.+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clin. Chest. Med. 15, 675-675 (1994).</li>
<li>Miller, R. G., Rosenberg, J. A., Gelinas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+parameter%3A+the+care+of+the+patient+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28an+evidence-based+review%29%3A+report+of+the+Quality+Standards+Subcommittee+of+the+American+Academy+of+Neurology%3A+ALS+Practice+Parameters+Task+Force%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force.</a> Neurology. 52, 1311-1323 (1999).</li>
<li>Mitsumoto, H., Chad, D. A., Pioro, E. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMitsumoto%2C+H+%22Amyotrophic+lateral+sclerosis%22">Amyotrophic lateral sclerosis</a>. Davis, F. A. , Philadelphia. (1998).</li>
<li>Tandan, R., Bradley, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+leteral+sclerosis%3A+Part+2.+Etiopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic leteral sclerosis: Part 2. Etiopathogenesis.</a> Annals of neurology. 18, 419-419 (1985).</li>
<li>Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+mechanisms+involved+in+motor+neuron+degeneration+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS.</a> Annu Rev Neurosci. 27, 723-723 (2004).</li>
<li>Rosen, D. R., Siddique, T., Patterson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cu%2FZn+superoxide+dismutase+gene+are+associated+with+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature. 362, 59-59 (1993).</li>
<li>Bruijn, L. I., Becher, M. W., Lee, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS-linked+SOD1+mutant+G85R+mediates+damage+to+astrocytes+and+promotes+rapidly+progressive+disease+with+SOD1-containing+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions.</a> Neuron. 18, 327-327 (1997).</li>
<li>Gurney, M. E., Pu, H., Chiu, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
<li>Howland, D. S., Liu, J., She, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+loss+of+the+glutamate+transporter+EAAT2+in+a+transgenic+rat+model+of+SOD1+mutant-mediated+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS).</a> Proc Natl Acad Sci. 99, 1604-1604 (2002).</li>
<li>Nagai, M., Aoki, M., Miyoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+expressing+human+cytosolic+copper-zinc+superoxide+dismutase+transgenes+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+associated+mutations+develop+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rats expressing human cytosolic copper-zinc superoxide dismutase transgenes with amyotrophic lateral sclerosis: associated mutations develop motor neuron disease.</a> J. Neurosci. 21, 9246-9246 (2001).</li>
<li>McDonald, W., Becker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+promising+interventions+and+realistic+goals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Phys.+Med.+Rehabi%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: promising interventions and realistic goals.</a> Am. J. Phys. Med. Rehabi. I82, S38-S38 (2003).</li>
<li>Sandrow-Feinberg, H. R., Zhukareva, V., Santi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+interferon-beta+modulates+the+acute+inflammatory+response+and+recovery+when+combined+with+forced+exercise+following+cervical+spinal+contusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">PEGylated interferon-beta modulates the acute inflammatory response and recovery when combined with forced exercise following cervical spinal contusion injury.</a> Experimental neurology. 223, 439-451 (2010).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1433 (2000).</li>
<li>Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+circuitry+and+respiratory+recovery+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+physiology+%26+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury.</a> Respiratory physiology & neurobiology. 169, 123-123 (2009).</li>
<li>Lepore, A. C., Rauck, B., Dejea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nature. 11, 1294-1294 (2008).</li>
<li>Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+and+Restricted+Precursors+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Multipotent and Restricted Precursors in the Central Nervous System.</a> Anat Rec. 257, 137-137 (1999).</li>
<li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-+restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Glial- restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Dev Biol. 188, 48-48 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Tork, C., Shelley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS.+Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph+Lateral+Scler%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS.</a> Amyotroph Lateral Scler. 8, 20-20 (2007).</li>
<li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., Gasmi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain research. 1185, 256-256 (2007).</li>
<li>Veldink, J. H., Bar, P. R., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+differences+in+onset+of+disease+and+response+to+exercise+in+a+transgenic+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Sexual differences in onset of disease and response to exercise in a transgenic model of ALS.</a> Neuromuscul Disord. 13, 737-737 (2003).</li>
<li>Shumsky, J. S., Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Neuronal+and+Glial+Restricted+Precursors+into+Contused+Spinal+Cord+Improves+Bladder+and+Motor+Functions%2C+Decreases+Thermal+Hypersensitivity%2C+and+Modifies+Intraspinal+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Neuronal and Glial Restricted Precursors into Contused Spinal Cord Improves Bladder and Motor Functions, Decreases Thermal Hypersensitivity, and Modifies Intraspinal Circuitry.</a> J. Neurosci. 25, 9624-9624 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W badaniach z wykorzystaniem myszy i szczurów SOD1G93A należy dobrać zwierzęta w obrębie grupy pod kątem wieku i płci oraz przydzielić zwierzęta z tego samego miotu do różnych grup. W przypadku modeli ALS i SCI preferowane jest stosowanie zwierząt jednej płci, ponieważ przebieg choroby może różnić się u samców i samic; jednakże użyteczne może być również zastosowanie wystarczającej liczby zwierząt obu płci w celu wykrycia ewentualnych efektów specyficznych dla płci, gdyż zjawisko to zgłaszano w przypadku szczu...

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>0.05% trypsyny</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny z soi (opcjonalnie)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6522</td><td></td></tr><tr><td>Maleinian acepromazyny (0.7 mg/kg)</td><td>Fermenta Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (95 mg/kg)</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (10 mg/kg)</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne typu Feather #11</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72044-11</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką (6 cali)</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta z ząbkami szczurzymi</td><td>Fine Science Tools</td><td>Rat: 11023-15; Mouse: 11042-08</td><td></td></tr><tr><td>Średnie nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Mini nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Kuszcza (rongeur)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Rat: 16121-14; Mouse: 16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Mikronóż</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Igłotrzymacze</td><td>Fine Science Tools</td><td>12502-14</td><td></td></tr><tr><td>Szew: 4-0</td><td>Vicryl</td><td>S-183</td><td></td></tr><tr><td>Klamry: 9 mm</td><td>Autoclip</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Zszywacz: 9 mm (Reflex #203-1000)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>5000344</td><td></td></tr><tr><td>Pompa do ciepłej wody (T/Pump)</td><td>Gaymar Industries</td><td>P/N 07999-000</td><td></td></tr><tr><td>cyklosporyna A: ampułki 250.0 mg/5.0 mL</td><td>Novartis AG</td><td>NDC 0078-0109-01</td><td></td></tr><tr><td>FK-506</td><td>LC Laboratories</td><td>F-4900</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycyna</td><td>LC Laboratories</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>Injektor</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP2</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler pompy mikrosyrgowej Micro 4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMC4</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kite-R</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 10.0 &amp;mu;L</td><td>Hamilton Co</td><td>80030</td><td></td></tr><tr><td>Igły Hamilton: 33-gauge, skos 45&amp;#x00B0;, 1 cal</td><td>Hamilton Co</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Szklane mikropipety kapilarne 20.0 &amp;mu;L (opcjonalnie)</td><td>Kimble Chase</td><td>71900-20</td><td></td></tr></tbody></table>

wewnątrzrdzeniowa transplantacja komórek w celu ukierunkowania na przednie rogi rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym w stwardnieniu bocznym zanikowym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego

Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

Niewydolność oddechowa spowodowana utratą ruchowych neuronów nerwu przeponowego jest wyniszczającym następstwem znacznej części przypadków urazowych uszkodzeń rdzenia kręgowego (SCI) u ludzi 1 oraz bezpośrednią przyczyną śmierci u pacjentów z chorobą neuronów ruchowych, bocianym stwardnieniem amerykańskim (ALS) 2.
ALS to wyniszczające schorzenie neurologiczne, które charakteryzuje się stosunkowo szybką degeneracją górnych i dolnych neuronów ruchowych. Pacjenci ostatecznie zapadają na chorobę średnio od 2 do 5 lat po diagnozie z powodu paraliżu oddechowego wynikającego z utraty unerwienia przepony przez neurony ruchowe nerwu przeponowego 3. Zdecydowana większość przypadków ma charakter sporadyczny, natomiast 10% to postać rodzinna. Około dwudziestu procent przypadków rodzinnych jest powiązanych z różnymi mutacjami punktowymi w genie dysmutazy ponadtlenkowej 1 (SOD1) zawierającej miedź i cynk (Cu/Zn) na chromosomie 21 4. Stworzono transgeniczne myszy 4,5 i szczury 6 niosące zmutowane ludzkie geny SOD1 (G93A, G37R, G86R, G85R), które mimo istnienia innych modeli zwierzęcych utraty neuronów ruchowych, są obecnie najczęściej wykorzystywanymi modelami tej choroby.
Uraz rdzenia kręgowego (SCI) to heterogeniczna grupa stanów wynikających z fizycznego urazenia rdzenia kręgowego, przy czym efekty funkcjonalne różnią się w zależności od rodzaju, lokalizacji i stopnia ciężkości urazu 7. Niemniej jednak, około połowy przypadków SCI u ludzi dotyczy odcinków szyjnych, co prowadzi do wyniszczającej dysfunkcji oddechowej z powodu utraty motoneuronów przeponowych oraz uszkodzenia zstępujących aksonów oddechowych opuszkowo-rdzeniowych 1. Opracowano szereg zwierzęcych modeli SCI, z których najczęściej stosowanym i najbardziej istotnym klinicznie jest model kontuzyjny 8.
Transplantacja różnych klas komórek prekursorowych neuronów (NPCs) stanowi obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu urazowych uszkodzeń OUN oraz neurodegeneracji, w tym ALS i SCI, ze względu na zdolność do zastępowania utraconych lub dysfunkcyjnych typów komórek OUN, zapewniania neuroprotekcji oraz dostarczania wybranych czynników genowych 9.
Modele zwierzęce zarówno ALS, jak i SCI mogą odwzorowywać wiele istotnych klinicznie aspektów tych schorzeń, w tym utratę neuronów ruchowych nerwu przeponowego i wynikające z tego zaburzenia oddechowe 10,11. Aby ocenić skuteczność strategii opartych na NPC w zakresie funkcji oddechowych w tych zwierzęcych modelach ALS i SCI, interwencje komórkowe muszą być skierowane konkretnie do obszarów zawierających cele terapeutyczne, takich jak neurony ruchowe nerwu przeponowego. Przedstawiamy szczegółowy protokół wielosegmentowego, wewnątrzrdzeniowego przeszczepiania NPC do przedniej szarej substancji szyjnego rdzenia kręgowego w modelach neurodegeneracyjnych, takich jak myszy i szczury SOD1G93A, a także w przypadku szczurów i myszy z uszkodzeniem rdzenia kręgowego 11.

Transplantacja prekursorów neuronalnych jest obiecującą strategią ochrony i/lub zastępowania utraconych lub dysfunkcyjnych szyjnych neuronów ruchowych nerwu przeponowego w przypadku urazów rdzenia kręgowego (SCI) oraz w przebiegu stwardnienia bocznego zanikowego (ALS), będącego chorobą neuronów ruchowych. Przedstawiamy protokół dostarczania komórek do przedniego rogu szyjnego rdzenia kręgowego w gryzoniach w modelach ALS i SCI.

Wewnątrzrdzeniowa transplantacja komórek w celu ukierunkowania na przednie rogi rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym w stwardnieniu bocznym zanikowym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego

Niewydolność oddechowa spowodowana utratą motoneuronów nerwu przeponowego jest wyniszczającą konsekwencją znacznej części urazowych uszkodzeń rdzenia kręgowego (SCI) u ludzi...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wieloodcinkowy, segmentowy przeszczep wewnątrzrdzeniowy prekursorowych komórek nerwowych do rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym, do brzusznej istoty szarej u szczurów i myszy. Osiąga się to poprzez wcześniejsze przygotowanie odpowiedniego typu prekursorowych komórek nerwowych do transplantacji, a następnie przeprowadzenie laminektomii rdzenia kręgowego w każdym punkcie planowanego przeszczepienia komórek.Następnie komórki są odpowiednio wstrzykiwane w odpowiednich miejscach i na odpowiedniej głębokości, aby precyzyjnie skierować dostarczenie komórek do przedniego rogu szyjnego rdzenia kręgowego. Ostatnim krokiem jest kontynuowanie podawania immunosupresji zwierzęciu aż do momentu uśmiercenia, aby zapewnić przeżycie przeszczepionych komórek w rdzeniu kręgowym. Ostatecznie, za pomocą metod histologicznych, takich jak immunohistochemia i późniejsza analiza mikroskopowa, można uzyskać wyniki pozwalające na śledzenie przeżywalności, migracji i różnicowania przeszczepionych neuronalnych komórek prekursorowych w dorosłym szyjnym rdzeniu kręgowym w różnych punktach czasowych po transplantacji.Prezentacja wizualna w tej metodzie jest kluczowa, ponieważ wiele zawiłych etapów chirurgii rdzenia kręgowego i transplantacji komórek jest trudnych do opanowania, gdyż wymagają one ogromnej staranności oraz specyficznych technik, a obrazowanie ułatwia ich naukę. Jeśli zastosowane zostaną zalecane procedury, na trzy dni przed transplantacją należy przeprowadzić immunosupresję zwierzęcia poprzez codzienne podawanie cyklosporyny A w dawce 10 mg/kg masy ciała w formie iniekcji podskórnej. W przypadku transplantacji komórek pochodzących od gryzoni, należy podawać 1 mg/kg masy ciała zarówno FK 5 0 6, jak i rapamycyny w formie iniekcji doszpikowej.Jeśli planowany jest przeszczep komórek pochodzenia ludzkiego, należy również uformować z wytrzymałych spinaczy do papieru retraktory. Odłam część spinacza, aby utworzyć haczyk, a drugi koniec zgnij w małą pętlę. Następnie przewiąż sznurek przez pętlę każdego retraktora, a w dniu operacji wysterylizuj w autoklawie retraktory oraz wszystkie instrumenty, które będą wykorzystane podczas zabiegu.Przygotować alikwoty komórek progenitorowych gleju lub innych komórek do transplantacji zgodnie z procedurami opisanymi w protokole pisemnym. Po zebraniu komórek rozdzielić zawiesiny komórkowe do kilku probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i przechowywać w lodzie. Następnie, po podaniu zwierzęciu odpowiedniej metody znieczulenia, potwierdzić osiągnięcie stanu znieczulenia umożliwiającego operację, wykonując test uciśnięcia palca u nogi.Używając strzygarki elektrycznej, należy ogolić grzbiet zwierzęcia – obszar od miejsca nieco rostralnie względem uszu do środka grzbietu. Należy dokładnie ogolić skórę i usunąć odcięte włosy, aby zapobiec ich przedostaniu się do linii cięcia. Następnie należy nasączyć kawałek gazy roztworem antyseptycznym z jodopowidonem i przemyć nim skórę w ogolonym obszarze. Skórę należy wyszorować co najmniej dwukrotnie roztworem antyseptycznym oraz dwukrotnie alkoholem lub rozcieńczonym środkiem dezynfekcyjnym, wykonując ruchy okrężne.Zacznij od miejsca nacięcia, kierując się na zewnątrz w stronę linii włosów. Połóż sterylną zwiniętą gazę na czystej desce zabiegowej i przymocuj ją do deski taśmą tak, aby się nie przesuwała. Umieść zwierzę na zwiniętej gazie w pozycji pronacji.Wyprostuj obie kończyny przednie zwierzęcia na podkładce, a następnie przymocuj je taśmą do podkładki i stołu operacyjnego, aby unieść rdzeń kręgowy w odcinku szyjnym. Ułatwi to pracę podczas całego zabiegu, ponieważ rdzeń szyjny znajduje się głęboko pod powierzchnią skóry. Podczas tej procedury należy użyć sterylnego pola operacyjnego, choć nie pokazano tego na filmie w celach demonstracyjnych.W pierwszej kolejności, patrząc przez mikroskop chirurgiczny ustawiony na najniższym powiększeniu, należy użyć ostrego, sterylnego skalpela, aby wykonać nacięcie w linii środkowej od podstawy czaszki do łopatki. Następnie należy wykonać nacięcie przez trzy warstwy mięśni nad kolumną kręgową. Należy zastosować odpowiedni nacisk, aby przeciąć wszystkie warstwy mięśni przy minimalnej liczbie nacięć, jednak nie należy naciskać zbyt mocno, ponieważ może to spowodować uszkodzenie głębszych tkanek za pomocą dwóch aplikatorów z bawełnianym końcem.Za pomocą ruchu obrotowego oddziel mięsień powierzchniowy od mięśnia przykręgowego. Nie należy przecinać ani rozrywać mięśnia, aby uniknąć krwotoku. Umieść cztery wykonane samodzielnie rozstępniki w odpowiednich pozycjach, aby odsunąć mięsień.Następnie odciągnij każdy z czterech haków w stronę wszystkich czterech rogów i przyklej sznurki do deski, aby unieruchomić haki. Końcowe pole operacyjne powinno mieć kształt kwadratu lub prostokąta. Użyj kleszczyków z ząbkami oraz sprężynowych nożyczek średniej wielkości, aby usunąć mięśnie przykręgosłupowe z grzbietowej powierzchni kręgów.Wykonaj nacięcia bardzo blisko kości, aby lepiej odsłonić jej powierzchnię. Upewnij się, że nacięcia są równoległe do powierzchni kręgów, ale nie przecinaj rdzenia kręgowego. Zamień średnie nożyczki sprężynowe na nożyczki typu raw share.Następnie unieruchom całą kolumnę kręgową, chwytając mięsień nad wyrostkiem C2 szczypcami ząbkowanymi do szczurów i użyj nożyczek chirurgicznych, aby odsunąć mięśnie na poziomie C4, C5 i C6. Następnie rozpocznij laminektomię na poziomie C5. Ponownie unieruchom obszar, trzymając C2 szczypcami ząbkowanymi do szczurów.Chwyć całą blaszkę łuku kręgowego za pomocą kleszczy i ustaw je tak, aby narzędzie znajdowało się całkowicie prostopadle do osi kolumny kręgosłupa. Powoli i delikatnie zmiażdż blaszkę, nie naciskając w stronę rdzenia kręgowego. Następnie ostrożnie wyciągnij odłamany fragment kości do góry.Następnie ustaw surowy ger prostopadle do kolumny kręgosłupa. Potem delikatnie wprowadź surowy ger pod kość pod kątem od 30 do 60 stopni względem powierzchni rdzenia. Wykonaj niewielkie nacięcia, aby rozszerzyć laminektomię na wszystkie łuki kręgów od C4 do C6.Nie należy rozszerzać laminektomii zbyt daleko bocznie, ponieważ spowoduje to krwotok. Zwiększyć powiększenie mikroskopu do około 15 x i skupić się na rdzeniu. Użyć prostego ostrego narzędzia.Za pomocą pęsety nr 5 usuń tkankę łączną znajdującą się na oponie twardej. Następnie użyj mini nożyczek sprężynowych lub mikronoża, aby naciąć oponę twardą równolegle do osi kręgosłupa. W punkcie położonym przyśrodkowo względem strefy wejścia korzonków grzbietowych upewnij się, że opona twarda została przebita w miejscu przeznaczonym do wstrzyknięcia.Po przebiciu, z opony twardej wypłynie płyn mózgowo-rdzeniowy; należy osuszyć powierzchnię rdzenia oraz cały obszar odsłonięcia za pomocą gazy lub aplikatora z bawełnianą końcówką. Używając pęsety, należy uchwycić i delikatnie unieść oponę twardą od rdzenia kręgowego, tak aby nie ścisnąć ani nie uszkodzić rdzenia. Należy nieco rozszerzyć nacięcie w stronę rostralną rdzenia, używając wymiennej igły strzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL.Wyposażono w ostrą metalową igłę Hamiltona o rozmiarze 33 G z zakończeniem ściętym pod kątem 45 stopni. Powoli pobierz wymaganą objętość zawiesiny komórkowej dla jednego miejsca iniekcji. Opuszczaj końcówkę igły w kierunku grzbietowej powierzchni rdzenia kręgowego, monitorując jej postęp przez mikroskop.Ustaw strzykawkę w osi kolumny kręgosłupa, aby precyzyjnie nakierować ją na pożądany obszar anatomiczny, kierując igłę tak, aby kąt wlotu był jak najbliższy 90 stopniom i znajdował się przyśrodkowo względem strefy wejścia korzonków grzbietowych. Delikatnie dotknij końcówką igły powierzchni rdzenia kręgowego, lekko go ugniatając. Następnie wycofaj igłę, aż rdzeń kręgowy powróci do normalnego położenia.Zapisz tę pozycję jako Z równa się 0,0, korzystając z linijki na mikromanipulatorze. Następnie, monitorując postępy przez mikroskop, delikatnie wprowadź igłę do rdzenia kręgowego. Obniż igłę o 1,5 milimetra, aby celować w róg przedni u dorosłego szczura.Pozostaw igłę w miejscu od dwóch do pięciu minut przed rozpoczęciem wstrzykiwania. Upewnij się, że zestaw chirurgiczny pozostaje nieruchomy w tym czasie. Następnie, za pomocą sterownika pompy, wstrzyknij 2 µL komórek w czasie od dwóch do pięciu minut przy stałej prędkości; po wstrzyknięciu pozostaw igłę w miejscu od dwóch do pięciu minut.Następnie ostrożnie wyciągnij igłę z rdzenia kręgowego. Powtórz proces iniekcji dla pozostałych miejsc docelowych. Po wykonaniu wszystkich iniekcji w miejscach docelowych, ustaw mikroskop na najniższym powiększeniu i nałóż szwy.Zamknięto jednocześnie wszystkie trzy nadkładające się warstwy mięśniowe, stosując szew 4-0 w trzech miejscach wzdłuż osi rostralno-kaudalnej. Zamknięto skórę za pomocą dziewięciomilimetrowych zszywek chirurgicznych, dbając o to, aby były one rozmieszczone w odstępach około 0,5 cm. Zaciśnięto zszywki za pomocą uchwytów igłowych, aby zapobiec ich wyrwaniu przez zwierzę przed pełnym wygojeniem rany.Nanieś antyseptyczny roztwór powidonu IRD na obszar rany ciętej za pomocą nasączonej gazy i pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu na cyrkulacyjnej podkładce z ciepłą wodą. Kontynuuj codzienne iniekcje cyklosporyny A lub rapamycyny FK 5 0 6 aż do momentu uśmiercenia 50 000 myszy. Komórki progenitorowe gleju wszczepiono do rogu przedniego rdzenia kręgowego na poziomie C4 u szczura SOD one G 93 a.Obraz ten pokazuje, że dwoje myszy pozytywnych dotarło do celu, przeszczepione komórki przeżyły miesiąc po transplantacji i zlokalizowały się w brzusznej istocie szarej, jednak miejsce wstrzyknięcia w płaszczyźnie przyśrodkowej ominęło boczny róg przedni, co zaznaczono linią przerywaną. Jak widać, wstrzyknięcie znacznie większej liczby komórek do tego obszaru prowadzi do uszkodzeń w miejscu wstrzyknięcia oraz wzdłuż toru igły. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w około 45 do 60 minut dla sześciu miejsc wstrzyknięcia, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia.

intraspinal-cell-transplantation-for-targeting-cervical-ventral-horn

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przeszczep komórek śródrdzeniowych w celu leczenia przedniego rogu rdzenia kręgowego w stwardnieniu bocznym zanikowym i pourazowych uszkodzeniach rdzenia kręgowego

Szczegółowo opisano transplantację mysich komórek macierzystych neuronów (NSCs) do rdzenia kręgowego myszy z utrwaloną demielinizacją. Przedstawiono przygotowanie NSCs, laminektomię dziewiątego kręgu piersiowego (T9) oraz transplantację NSCs, wraz z opieką przed- i pooperacyjną nad myszami.

Chirurgiczna transplantacja neuralnych komórek macierzystych myszy do rdzeni kręgowych myszy zainfekowanych neurotropowym wirusem zapalenia wątroby myszy

Źródło: Zweckberger, K., et al. Synergiczne zastosowanie neuronalnych komórek prekursorowych i samoorganizujących się peptydów w eksperymentalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym.  J. Vis. Exp. (2015).Protokół ten demonstruje ukierunkowane podejście do iniekcji w celu naprawy urazu rdzenia kręgowego w modelu szczurzym. Polega na dostarczeniu samoorganizujących się peptydów (SAP) do rdzenia zmiany chorobowej w celu stworzenia rusztowania nośnego, a następnie wstrzyknięciu komórek...

Wstrzykiwanie samoorganizujących się peptydów i nerwowych komórek prekursorowych w celu naprawy rdzenia kręgowego w modelu szczurzym

Matryce fibrynowe zawierające czynniki wzrostu zostały użyte do zatrzymania przeszczepionych nerwowych komórek macierzystych w miejscach całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego. Przeszczepione komórki całkowicie wypełniły jamę chorobową i zróżnicowały się w wiele typów komórek nerwowych, w tym neurony, które rozciągały aksony do rdzenia kręgowego gospodarza na duże odległości.

Promowanie przeżycia i różnicowania nerwowych komórek macierzystych z koktajlami fibryny i czynnika wzrostu po ciężkim urazie rdzenia kręgowego

Leczenie uszkodzeń rdzenia kręgowego odcinka szyjnego zarówno za pomocą peptydów samoorganizujących się (SAP), jak i nerwowych komórek prekursorowych (NPC), wraz z czynnikami wzrostu, jest obiecującym podejściem do promowania regeneracji i regeneracji. Ustalono szczurzy model klisa do stłuczenia/ucisku tętniaka szyjki macicy i leczenia skojarzonego obejmującego wstrzyknięcie SAP i przeszczep NPC.

Synergiczne zastosowanie neuronalnych komórek prekursorowych i samoorganizujących się peptydów w eksperymentalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym

Uraz rdzenia kręgowego to traumatyczny stan, który powoduje ciężką zachorowalność i wysoką śmiertelność. W niniejszej pracy szczegółowo opisano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy, po którym następuje przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych.

Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

Poważne urazy rdzenia kręgowego często skutkują wadami tkanek. Opisano dwie możliwości skutecznego wypełnienia takich luk w celu promowania adaptacji tkanek, reakcji regeneracyjnych i poprawy funkcjonalnej u szczurów poprzez wszczepienie mechanicznego systemu mikrołączników po ostrym urazie i pięć tygodni po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego.

Eksperymentalne strategie wypełniania dużych luk tkankowych w uszkodzonym rdzeniu kręgowym po ostrym i przewlekłym uszkodzeniu

Ten artykuł opisuje technikę wprowadzania pustego przewodu między kikuty rdzenia kręgowego po całkowitym przecięciu i wypełnieniu komórkami Schwanna (SC) oraz wstrzykiwalną macierzą błony podstawnej w celu wypełnienia i wspomagania regeneracji aksonów w poprzek szczeliny.

Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki

W tym artykule przedstawiamy powtarzalną metodę generowania i utrzymywania długoterminowych wycinków organotypowych rdzenia kręgowego przeszczepionych z nerwowymi komórkami macierzystymi jako model ex vivo do testowania komórkowych terapii zastępczych.

Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego

W tym badaniu opracowano i scharakteryzowano kompozytowe hydrożele mimetyczne nerwowe, które mogą być wykorzystywane do badania i wykorzystania proregeneracyjnego zachowania komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu do naprawy urazu rdzenia kręgowego.

Rozwój kombinatorycznych terapii w leczeniu urazów rdzenia kręgowego z wykorzystaniem dostarczania komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje rozwój powtarzalnego mysiego modelu glejaka rdzenia kręgowego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych do przestrzeni międzykręgowej, oferując bardziej efektywne i mniej inwazyjne podejście do badań i rozwoju terapeutycznego.

Chirurgiczny przeszczep komórek nowotworowych do rdzenia kręgowego myszy

Poznaj metodę przeszczepu komórek śródrdzeniowych do rogu brzusznego rdzenia szyjnego u szczurów i myszy w modelach stwardnienia zanikowego bocznego oraz urazowego uszkodzenia rdzenia kręgowego.

Przeszczep komórek śródrdzeniowych w celu ukierunkowania na róg brzuszny szyjki macicy w stwardnieniu zanikowym bocznym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal

Wewnątrzrdzeniowa transplantacja komórek w celu ukierunkowania na przednie rogi rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym w stwardnieniu bocznym zanikowym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów