Obrazowanie w czasie rzeczywistym fagocytozy makrofagów krwinek czerwonych z opsonizowanymi IgG

Weź slajd kanału zawierający makrofagi myszy. Kanał łączy się ze zbiornikami wypełnionymi pożywką, dostarczając składniki odżywcze makrofagom.

Zastąp pożywkę przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie zawierającymi pożywki, które wiążą się ze specyficznymi glikoproteinami powierzchniowymi, znakując makrofagi.

Weźmy ludzkie czerwone krwinki, RBC, z fluorescencyjnie znakowanymi błonami komórkowymi. Opsonizacja erytrocytów mysimi przeciwciałami IgG, które wiążą się specyficznie z glikoforyną A.

Dodaj erytrocyty opsonizowane IgG do szkiełka zawierającego makrofagi. Receptory Fc makrofagów wiążą region Fc IgG na krwinkach czerwonych, co powoduje grupowanie receptorów Fc wokół obszaru kontaktu i oznaczanie erytrocytów dla fagocytozy.

Wiązanie wyzwala wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe i aktywuje GTPazy. Aktywowane GTPazy napędzają reorganizację i polimeryzację aktyny, tworząc cienkie wypukłości błony zwane filopodiami.

Ponadto filopodia rozciągają się wokół RBC, zamykając je w rozwijającej się miseczce fagocytarnej. Krawędzie miseczki łączą się, tworząc fagosom, który internalizuje opsonizowane RBC w celu degradacji.

Za pomocą mikroskopu konfokalnego uzyskaj obrazy poklatkowe pojedynczych zdarzeń fagocytarnych.

Aby oznaczyć makrofagi otrzewnowe, zastąp pożywkę wodorowęglanową w każdym szkiełku kanałowym kompletną pożywką uzupełnioną HEPES i przechyl szkiełko, aby umożliwić dodanie 100 mikrolitrów fluorescencyjnie znakowanego mysiego przeciwciała specyficznego dla makrofagów, które jest przedmiotem zainteresowania, kroplami do otworu 100-mikrolitrowego kanału szkiełka. Zassać pożywkę, która wpływa do zbiornika znajdującego się za nią, i inkubować komórki przez 20 minut w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy braku dwutlenku węgla.

Podczas znakowania komórek otrzewnej delikatnie wymieszaj od 4 do 2,000 próbek czerwonych krwinek i przenieś 400 mikrolitrów komórek do nowej 2-mililitrowej probówki mikrowirówkowej w podgrzewanym aluminiowym bloku wewnątrz okapu z przepływem laminarnym przez około 5 do 8 minut.

Gdy komórki ogrzeją się do 37 stopni Celsjusza, wymieszaj 0,4 mikrolitra odpowiedniego czerwonego fluorescencyjnego barwnika plazmatycznego z komórkami i umieść komórki z powrotem w bloku grzewczym. Po 5 minutach umyj komórki, dodając 1,6 mililitra świeżej kompletnej pożywki uzupełnionej HEPS i odwiruj. Obróć probówkę, aby zidentyfikować osad czerwonych krwinek.

Za pomocą końcówki do pipet o pojemności od 1 do 1,5 mililitra ostrożnie usunąć supernatant w dwóch objętościach, nie naruszając osadu. Następnie wymieszaj 2,000 mikrolitrów świeżej kompletnej pożywki uzupełnionej HEPES z komórkami. Odwirować i ponownie zawiesić osad w 400 mikrolitrach pożywki. Następnie oznacz probówkę PMS jako Plasma Membrane Stain. Pod koniec 20-minutowej inkubacji znakowania komórek otrzewnej przemyć szkiełko 1 mililitrem świeżej, kompletnej pożywki uzupełnionej HEPES.

Aby opsonizować czerwone krwinki, dodaj 1 mikrolitr mysiego monoklonalnego przeciwciała anty-ludzkiego anty-ludzkiego CD235a do probówki z próbką PMS. Po 8 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem raz na minutę przenieś 100 mikrolitrów wybarwionych błoną plazmatyczną, opsonizowanych IgG, ludzkich czerwonych krwinek do szkiełka kanałowego zawierającego makrofagi otrzewnowe. Jak tylko ludzkie krwinki czerwone zostaną dodane, zamontuj szkiełko na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem z inkubatorem ustawionym na 37 stopni Celsjusza i natychmiast rozpocznij obrazowanie komórek.