JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 2:53 min • July 8th, 2025
Na początek weź probówkę zawierającą komórki rakowe w pożywce bez surowicy, aby zminimalizować interferencję esterazy surowicy podczas testu. Inkubować z niefluorescencyjnym barwnikiem kalceiny AM.
Aktywne esterazy wewnątrzkomórkowe hydrolizują kalceinę AM do nieprzepuszczalnego dla błony fluorescencyjnego barwnika kalceinowego zatrzymanego w cytoplazmie.
Płytki barwione kalceiną komórki rakowe i efektorowe komórki NK w dołkach testowych, podczas gdy studzienki kontrolne zawierają tylko komórki rakowe barwione kalceiną bez komórek NK.
Receptory powierzchniowe komórek NK aktywujące wiążą się z aktywującymi ligandami na komórkach nowotworowych, tworząc synapsę immunologiczną. To wiązanie aktywuje sygnalizację komórkową NK, polaryzując cytotoksyczne granulki zawierające perforyny i granzymy w kierunku synapsy w celu uwolnienia.
Perforyny tworzą pory błony komórkowej raka, ułatwiając wnikanie granzym do komórek i inicjując apoptozę. Naruszona integralność błony powoduje fluorescencyjny wyciek kalceiny, zmniejszając fluorescencję komórek rakowych.
Uchwyć obrazy fluorescencyjne studni.
Zmniejszona liczba fluorescencyjnych żywych komórek rakowych w studzienkach zawierających komórki NK niż w studzienkach kontrolnych wskazuje na cytotoksyczność komórek NK w stosunku do komórek rakowych.
Aby ocenić cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK przy użyciu wapnia AM, po wyhodowaniu komórek linii komórkowej ludzkiego raka wątroby do 70% do 80% konfluencji, jak pokazano, ponownie zawieś komórki w 3 mililitrach DMEM bez surowicy i oznacz komórki 1,5 mikrolitra 10 milimolowego roztworu wapnia AM przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i przemyć komórki dwa razy 5 mililitrami PBS na przemycie.
Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1 x 105 komórek na mililitr pożywki hodowlanej i dodać 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki w trzech powtórzeniach na warunki traktowania. Następnie dodaj 1 x 105 ludzkich komórek NK w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej do każdej studzienki komórek docelowych i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na cztery godziny.
Po zakończeniu inkubacji należy uchwycić co najmniej 10 różnych pól obrazów komórek AM wapnia AM dla każdej kontrpróby każdego stanu leczenia pod mikroskopem fluorescencyjnym w 10-krotnym powiększeniu. Następnie oblicz procentową cytotoksyczność za pomocą wzoru.