Analiza efferocytozy apoptotycznych tymocytów przez makrofagi otrzewnowe

Efferocytoza to proces, w którym komórki fagocytarne usuwają komórki apoptotyczne.

Aby przeanalizować eferocytozę, uzyskaj mysie tymocyty podatne na apoptozę. Inkubować z przepuszczalnym dla komórek barwnikiem CFSE.

Wewnątrzkomórkowe esterazy rozszczepiają CFSE na nieprzepuszczalny dla komórek barwnik fluorescencyjny, barwiąc tymocyty. Dodaj serum inaktywowane termicznie, aby zapobiec nadmiernemu przebarwieniu.

Umieść wybarwione tymocyty na płytce hodowlanej. Dodaj staurosporynę, inhibitor kinazy białkowej, który zakłóca krytyczną kaskadę sygnalizacji komórkowej, indukując apoptozę. Co więcej, reszty fosfatydyloseryny przemieszczają się do zewnętrznego płatka błony komórkowej, działając jako "sygnały zjadaj mnie".

Dodaj rosnące apoptotyczne stężenia tymocytów do wielodołkowych studzienek płytkowych zawierających aktywowane mysie makrofagi otrzewnowe, które wyrażają specyficzne receptorowe kinazy tyrozynowe.

Kinazy te wiążą eksponowaną fosfatydyloserynę z apoptotycznymi tymocytami, ułatwiając ich internalizację przez makrofagi.

Po inkubacji usuń swobodnie pływające apoptotyczne tymocyty. Dodaj znakowane fluoroforem przeciwciała anty-CD11b, które wiążą się z cząsteczkami makrofagów CD11b.

Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego obserwuj fluorescencyjne apoptotyczne tymocyty w różnie fluorescencyjnych makrofagach, wskazujące na efferocytozę.

Studnie o wyższych stężeniach apoptotycznych tymocytów wykazują zwiększone zinternalizowane tymocyty.

Aby zebrać tymocyty po otwarciu jamy klatki piersiowej naiwnej myszy C57/Black-6, użyj zakrzywionych kleszczy z cienką końcówką, aby wyciągnąć grasicę. Umieść narząd w naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 10 mililitrów pożywki RPMI-1640. Zmiel całą grasicę na oszronionych końcach 2 szkiełek mikroskopowych i przefiltruj powstałą zawiesinę tkankową przez sitko do komórek o długości 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Zbierz tymocyty przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w 40 mililitrach.

Po zliczeniu ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś do 2 x 10⁸ komórek w 20 mililitrach świeżego PBS na 50-mililitrową probówkę. Oznacz komórki 5-mikromolowym CFSE w 20 mililitrach PBS na probówkę. Odwróć probówki dwa do trzech razy, aby wymieszać, przed inkubacją tymocytów przez nie więcej niż 2 minuty w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji zatrzymaj reakcję za pomocą 10 mililitrów inaktywowanej termicznie surowicy końskiej i zbierz komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić oznakowane komórki w 40 mililitrach świeżego PBS w celu zliczenia i odwirowania, a następnie dodatkowego przemycia 40 mililitrami pożywki. Po przepłukaniu pożywki ponownie zawieś tymocyty w stężeniu 7 x 10⁶ komórek na mililitr pożywki do hodowli tkankowych i umieść komórki w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych. Następnie dodać staurosporynę do hodowli komórkowej w końcowym stężeniu 1 mikromolowym i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 4 godziny.

W celu izolacji makrofagów otrzewnowej wstrzyknij dwóm myszom C57 / Black-6 dootrzewnowo 1 mililitr 3% dojrzałego tioglikolanu w dniu 0, przed otwarciem skóry brzucha bez naruszania otrzewnej w dniu 5.

Aby przepłukać jamę otrzewnową, użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 18, aby szybko wepchnąć 10 mililitrów buforu do płukania do jamy przed powolnym zasysaniem buforu do płukania w celu zebrania do 50-mililitrowej probówki. Umyj zgłębnik otrzewnej dwa razy za pomocą PBS. Ponownie zawiesić makrofagi otrzewnowe w stężeniu 2 razy 10 do szóstych komórek na mililitr pożywki do hodowli tkankowej.

Następnie wysiew 500 mikrolitrów makrofagów do każdej studzienki 24-dołkowej płytki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 2 godziny. Pod koniec inkubacji odessać supernatant w celu usunięcia pływających komórek i dodać 500 mikrolitrów pożywki do hodowli tkankowej do każdej studzienki.

Natychmiast dodać 0 do 12 x 10⁶ tymocytów w 500 mikrolitrach pożywki do każdego dołka kultury i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 4 godziny. Pod koniec inkubacji przemyć każdą studzienkę dwa razy świeżym PBS w celu usunięcia wszelkich swobodnie unoszących się komórek apoptotycznych, a następnie przepłukać pojedynczą wodą buforem barwiącym. Następnie oznacz makrofagi związane z płytką 200 mikrolitrami buforu barwiącego uzupełnionego odpowiednim przeciwciałem anty-CD11b na dołek i umieść płytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza na 20 minut.