JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:35 min • July 8th, 2025
Weź zjadliwe i mniej zjadliwe szczepy Staphylococcus aureus.
Dodaj surowicę, aby opsonizować bakterie.
Przenieść rosnące stężenie bakterii do schłodzonych wielodołkowych studzienek płytkowych zawierających neutrofile. Niskie temperatury uniemożliwiają aktywację neutrofili
.Wirówka ułatwiająca zsynchronizowaną fagocytozę.
Receptory neutrofilowe wiążą opsoniny, wywołując internalizację bakterii w fagosomach.
W przypadku zjadliwych bakterii środowisko fagosomalne wyzwala ekspresję toksyn cytolitycznych.
Toksyny te tworzą pory, zaburzając działanie fagosomów i naruszając integralność błony neutrofili
.Jednak mniej zjadliwe bakterie wykazują zmniejszoną ekspresję toksyny cytolitycznej.
Po inkubacji odłączyć neutrofile i przenieść je do probówek cytometru przepływowego zawierających barwnik fluorescencyjny jodku propydyny (PI).
Barwnik dostaje się do neutrofili z uszkodzonymi błonami i barwi DNA.
Za pomocą cytometru przepływowego przeanalizuj neutrofile pod kątem barwienia PI.
Zależny od stężenia wzrost odsetka granulocytów obojętno-dodatnich po fagocytozie zjadliwego szczepu, w porównaniu z mniej zjadliwym szczepem, wskazuje na cytotoksyczność zjadliwego szczepu wobec neutrofili.
Gdy subkulturowany gronkowiec złocisty osiągnie średni wykładniczy wzrost, przenieś 1 mililitr hodowanych bakterii do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej i wiruj przy 5000 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć S. aureus przez zasysanie supernatantu bez naruszania osadu i ponownie zawiesić granulowane bakterie w 1 mililitrowym DPBS. Wirować próbki przez 30 sekund. Odwirować próbki o masie 5000 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
Aby opsonizować gronkowca złocistego, najpierw ponownie zawieś osad bakteryjny w 1 mililitrze 20% ludzkiej surowicy. Następnie inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem przez 15 minut. Umyć opsonizowanego gronkowca złocistego po odwirowaniu, jak pokazano wcześniej. Rozcieńczyć opsonizowane szczepy Gronkowca złocistego do 1 x 108 jednostek tworzących kolonie, CFU na mililitr, z lodowatym RPMI. Wirować próbkę przez 30 sekund i umieścić na lodzie.
Potwierdź stężenia gronkowca złocistego użytego do tych testów, posiewając od 1 do 10 seryjnych rozcieńczeń bakterii na agarze . Delikatnie dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę każdego szczepu Staph aureus lub RPMI w celu kontroli pozytywnej i ujemnej PMN w 96-dołkowej płytce na lodzie od kroku 1.14. Delikatnie kołysz płytę, aby rozprowadzić gronkowca złocistego w studzienkach.
Zsynchronizować fagocytozę, odwirowując płytkę w temperaturze 500 g przez osiem minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i inkubując płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, bezpośrednio po odwirowaniu w czasie 0. W żądanych punktach czasowych połóż płytkę na lodzie i dodaj 200 mikrolitrów lodowatego DPBS zawierającego 1 mikrolitr jodku propidyny do każdej probówki do cytometrii przepływowej, a następnie przenieś próbki do odpowiedniej probówki.