Obrazowanie fluorescencyjne enzymów reporterowych do śledzenia infekcji bakteryjnych in vivo

Wystaw mysz na działanie kropelek aerozolu zawierających Mycobacterium tuberculosis.

Bakterie docierają do światła pęcherzyków płucnych – maleńkich woreczków powietrznych w płucach – zawierających makrofagi.

Receptory rozpoznawania wzorców makrofagów wiążą się z wzorcami molekularnymi bakterii związanymi z patogenami, powodując ich pochłonięcie przez fagosom.

Pochłonięte bakterie wydzielają wyspecjalizowane białka, które rozrywają błonę fagosomu. Bakterie uciekają do cytoplazmy i rozmnażają się.

Po zakażeniu znieczulić mysz. Dootrzewnowo podać substrat reporterowy bakteryjnego enzymu β-laktamazy do fluorescencji enzymu reporterowego lub obrazowania REF.

Substrat dociera do pęcherzyków płucnych poprzez krążenie i wnika do zakażonych komórek.

Przenika przez zewnętrzną błonę bakteryjną, aby dotrzeć do przestrzeni peryplazmatycznej zawierającej β-laktamazę.

Podłoże zawiera pierścień β-laktamowy łączący fluorochrom i wygaszacz. Ze względu na bliskość, fluorescencja fluorochromu jest absorbowana przez wygaszacz.

β-laktamaza hydrolizuje pierścień β-laktamowy, uwalniając fluorofor i powodując emisję fluorescencji.

Zobrazuj fluorescencję, aby ocenić infekcję prątkami.

Aby kontynuować, załaduj zwierzęta o znanej wadze do zasilanej komory zaszczepiającej. W komorze może zmieścić się do 90 myszy. Następnie zamknij wszystkie zatrzaski w drzwiach. Następnie podłącz nebulizator za pomocą stalowego zacisku. Następnie naciśnij przycisk start na komorze i ustaw natężenie przepływu powietrza w zakresie od 3 do 5 litrów na minutę.

Sprężone powietrze będzie przepływać z prędkością około 22 do 26 funtów na cal kwadratowy i co ważne, powinno być możliwe zobaczenie mgły inokulum w komorze. Po 15 minutach z przodu panelu sterowania pojawi się czerwona lampka, a sygnał dźwiękowy wskaże koniec biegu. Następnie naciśnij przycisk resetowania, aby zresetować timery. Aby zwolnić podciśnienie, naciśnij mały czerwony przycisk na drzwiach komory.

Następnie otwórz drzwi komory i włóż myszy z powrotem do ich domowych klatek. Idąc dalej, trzymaj zwierzęta w pomieszczeniu przechowawczym. Następnie zwróć słoik w pojemniku transportowym do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Tam wyrzuć pozostałą zawiesinę bakteryjną do wyznaczonego pojemnika na odpady. Następnie umieść zużyty słoik nebulizatora w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego i zamknij worek na czas transportu do autoklawu.

Aby wyczyścić komorę, spryskaj wewnętrzne powierzchnie buforowanym fenolem i 70% etanolem. Pozwól tym roztworom zareagować na tych powierzchniach przez 10 minut, a następnie dokładnie je zetrzyj. Wyrzuć wszystkie chusteczki do kosza na zagrożenia biologiczne. Następnie autoklaw śmieci, pojemnik na odpady i zużyte słoiki z nebulizatorem.

Przenieś zwierzęta do pomieszczenia do obrazowania. Tam znieczulij zwierzę zgodnie z protokołem tekstowym i wstrzyknij mu substrat kontrastowy przez wstrzyknięcie dootrzewnowe. W oprogramowaniu systemu obrazowania zainicjuj system i kontynuuj, gdy pasek temperatury zmieni kolor na zielony. Po zainicjowaniu systemu umieść mysz w komorze obrazowania.

Upewnij się, że jego nozdrza znajdują się w stożku nosa, aby otrzymał znieczulenie podczas obrazowania. Teraz wróć do komputera. W panelu sterowania akwizycji wybierz opcję fluorescencja, transiluminacja, aby wyświetlić całe zwierzę, lub epi-oświetlenie, aby wyświetlić tkanki płuc. W przypadku pojedynczej myszy ustaw pole widzenia na B, a poziom lampy na wysoki.

Do ekspozycji użyj automatycznego czasu, średniego łączenia i dwóch lub trzech dla przysłony. Następnie ustaw filtr wzbudzenia na 745 nanometrów, a filtry emisyjne na 780 na 840 nanometrów. Następnie przejdź do ustawień sekwencji i wybierz od 9 do 12 punktów transillumination w obszarze zainteresowania. Teraz naciśnij przycisk pozyskiwania, aby zebrać obrazy.