Dlaczego ilościowe oznaczenie wewnątrzkomórkowych amastigotów jest istotne dla walidacji celu terapeutycznego?

Kwantyfikacja wewnątrzkomórkowych amastigotów stanowi bezpośredni pomiar zjadliwości i zdolności do replikacji Leishmania w makrofagach, co umożliwia ocenę, czy dana substancja zaburza wewnątrzkomórkowy cykl życiowy patogenu. Ten odczyt fenotypowy wspiera walidację celu poprzez powiązanie inhibicji molekularnej z wynikami funkcjonalnymi w systemie istotnym dla przebiegu choroby.

W jaki sposób izolacja zmiennej replikacji wewnątrzkomórkowej wspiera proces wyszukiwania nowych kandydatów (discovery pipeline)?

Koncentrując się na formowaniu amastigot w wakuolach parazytoforowych, test izoluje etap replikacji wewnątrzkomórkowej jako kluczową zmienną zależną od wirulencji, co pozwala badaczom oceniać związki specyficznie blokujące różnicowanie lub przeżycie wewnątrz komórek gospodarza. Umożliwia toB minimalizację ryzyka w przypadku celów związanych z metabolizmem żelaza, dojrzewaniem fagosomów lub mechanizmami przetrwania pasożytów.

Co umożliwiają ilościowe pomiary jąder zainfekowanych makrofagów?

Ilościowy pomiar jąder amastigotów barwionych DAPI, zgromadzonych wokół jąder makrofagów, umożliwia obiektywne porównanie wskaźników infekcji w różnych warunkach doświadczalnych, co wspiera analizę zależności dawka-odpowiedź oraz potwierdzanie trafień w kampaniach przesiewowych. Dane te zapewniają skalowalny odczyt oparty na mikroskopii do oceny wpływu związków na obciążenie wewnątrzkomórkowe pasożytami.

Dlaczego wymagania dotyczące replikacji są istotne dla współpracy międzyfunkcyjnej?

Zdefiniowane wymagania dotyczące replikacji — w tym zestandaryzowane różnicowanie makrofagów, czas infekcji oraz protokoły utrwalania — zapewniają spójność testu pomiędzy laboratoriami i zespołami projektowymi, co umożliwia niezawodną wymianę i porównywanie danych. Wspiera to ciągłość translacyjną, pozwalając grupom zajmującym się odkryciami, przesiewaniem i badaniami przedklinicznymi na generowanie porównywalnych danych z oceny wirulencji.

Jakie możliwości analizy statystycznej są wymagane przed wdrożeniem?

Wdrożenie wymaga możliwości ilościowego określenia i porównania częstotliwości zainfekowanych komórek w różnych warunkach przy użyciu metod statystycznych, takich jak testy t lub ANOVA, w celu ustalenia istotnych różnic w obciążeniu amastigotami pomiędzy grupami badanymi a kontrolnymi. Umożliwia to dobór hitów w oparciu o dane oraz analizę relacji struktura-aktywność w ramach działań nad optymalizacją związków wiodących.

Ocena zjadliwości Leishmania w hodowlanych makrofagach

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologia

0 wyświetleń • 4:46 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozpocząć od płytki wielodołkowej zawierającej makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego na szkiełkach nakrywkowych.

Traktuj makrofagi promastigotykami Leishmania - stadium zakaźne pasożyta.

Podczas inkubacji pasożyty wchodzą w interakcje z makrofagami, ułatwiając gromadzenie się F-aktyny wokół miejsca interakcji.

Makrofagi pochłaniają pasożyty w fagosomach otoczonych F-aktyną, tworząc parazytoforyczne wakuole lub PV - niszę replikacyjną.

W PV pasożyty uwalniają czynniki przeżycia, zwiększając akumulację F-aktyny wokół wakuoli i hamując ich fuzję z lizosomami.

Dodatkowo pasożyty zwiększają produkcję hepcydyny – hormonu peptydowego makrofagów, hamując uwalnianie żelaza i podnosząc wewnątrzkomórkowy poziom żelaza.

Napływ żelaza do wakuoli sprzyja różnicowaniu promastigotów w patogenne amastigoty i ułatwia ich namnażanie, zwiększając zjadliwość.

Po inkubacji umyj w celu usunięcia wolnych pasożytów, a następnie napraw i przepuszczalność zainfekowanych makrofagów.

Wprowadź barwnik fluorescencyjny kwasu nukleinowego, aby zabarwić jądra zakażonych makrofagów i amastigotów.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym małe jądra skupione wokół dużego jądra makrofaga potwierdzają obecność pasożytów wewnątrzkomórkowych, demonstrując zjadliwość Leishmania.

W siódmym lub ósmym dniu po hodowli użyj zasysającej końcówki zamontowanej na linii próżniowej, aby przenieść cztery sterylizowane w autoklawie 12-milimetrowe szklane szkiełka nakrywkowe na dno każdego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej bez nakładania się na siebie. Przygotuj identyczne płytki dla każdego punktu czasowego eksperymentu. Następnie przemyj kultury makrofagów pochodzące ze szpiku kostnego 2 razy świeżym PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioma mililitrami PBS bez wapnia i magnezu, uzupełnionymi jednym milimolowym EDTA na każdą płytkę.

Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza połącz odłączone komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, przepłukując każdą płytkę dwa razy dodatkowymi pięcioma mililitrami PBS bez wapnia i magnezu. Po odwirowaniu ponownie zawiesić makrofagi w pięciu do 10 ml świeżej pożywki makrofagowej pochodzącej ze szpiku kostnego na lodzie. Po policzeniu rozcieńczyć komórki do stężenia 5 x 10⁵ na mililitr w świeżej pożywce makrofagowej pochodzącej ze szpiku kostnego i dodać dwa mililitry komórek na studzienkę do płytki 6-dołkowej. Następnie inkubuj komórki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Aby zainfekować komórki L. amazonensis, należy rozcieńczyć zawiesinę pasożyta do odpowiedniej doświadczalnej wielokrotności infekcji i dodać od 50 do 100 mikrolitrów pasożytów do każdej studzienki ze wszystkich sześciodołkowych płytek, w tym do wszystkich punktów czasowych eksperymentu. Inkubować makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego przez odpowiedni okres infekcji i temperaturę.

Następnie umyj studzienki trzy razy dwoma mililitrami świeżego PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wapnia lub magnezu na studzienkę i utrwal początkowe próbki punktu czasowego za pomocą 1,5 do 2 ml 2% paraformaldehydu przez 10 minut. W przypadku płytek odpowiadających późniejszym punktom czasowym dodać 2 mililitry świeżej pożywki makrofagowej pochodzącej ze szpiku kostnego do każdej studzienki i zwrócić płytki do odpowiedniego inkubatora. Następnie utrwal i umyj komórki dla każdego pozostałego punktu czasowego, jak właśnie pokazano, i przechowuj próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza w świeżym PBS.

Aby zabarwić komórki DAPI, zastąp supernatant 1,5 ml świeżego PBS bez wapnia i magnezu, uzupełniony 0,1% niejonowym detergentem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj trzy 2-mililitrowe płukania PBS bez wapnia i magnezu. Następnie wybarwić komórki dwoma mikrogramami na mililitr DAPI w 1 mililitrze PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po trzech praniach umieść szkiełka nakrywkowe komórką do dołu na pojedynczych szklanych szkiełkach mikroskopowych zamontowanych za pomocą dostępnego w handlu odczynnika zapobiegającego blaknięciu.

Następnie, aby określić ilościowo liczbę zainfekowanych komórek, użyj 100-krotnego obiektywu z olejkiem immersyjnym mikroskopu fluorescencyjnego i licznika Emanuela, aby zidentyfikować liczbę mniejszych jąder amastigotów skupionych wokół każdego dużego jądra makrofagów barwionego DAPI.