Test infekcji bakteryjnej do badania interakcji bakterii beztlenowych z komórkami gospodarza

Zacznij od hodowli komórek śródbłonka.

Zastąp pożywkę pożywką beztlenową. Inkubować w komorze beztlenowej w celu wyrównania temperatury.

Dodaj Porphyromonas gingivalis, chorobotwórczą bakterię beztlenową, i krótko inkubuj.

Bakterie posiadają wypustki białkowe, znane jako fimbrie, które wiążą się ze specyficznymi cząsteczkami adhezyjnymi na komórkach śródbłonka, ułatwiając przyleganie bakterii.

To wiązanie wyzwala wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne, powodując przegrupowanie cytoszkieletu aktynowego i internalizację bakterii w fagosomy.

Po inkubacji usuń pożywkę. Przemyć buforem beztlenowym w celu usunięcia nieprzylegających bakterii zewnątrzkomórkowych.

Dodaj łagodny detergent, aby przeniknąć przez błony komórkowe gospodarza i wywołać lizę komórek, uwalniając zinternalizowane i przyczepione do powierzchni bakterie bez powodowania uszkodzeń.

Rozcieńczyć bakterie zawierające lizat pożywką i przygotować seryjne rozcieńczenia.

Umieść te rozcieńczenia na płytkach z agarem z krwią. Inkubować w warunkach beztlenowych, aby umożliwić Porphyromonas gingivalis namnażanie się i tworzenie kolonii.

Po inkubacji policz jednostki tworzące kolonie (CFU) na każdej płytce, aby określić ilościowo bakterie przyczepione do powierzchni i zinternalizowane, wskazując interakcje bakteria-komórka gospodarza.

W celu hodowli i eksperymentów z Porphyromonas gingivalis utrzymywana jest winylowa komora beztlenowa ze sztuczną atmosferą zawierającą 80% azotu, 10% wodoru i 10% dwutlenku węgla.

Umieść 30 płytek z agarem z krwią, 500 mililitrów PBS i mililitrów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego lub pożywki VEGF w komorze beztlenowej 24 godziny wcześniej, aby zrównoważyć odczynniki.

Wysiewaj 4 razy 10 do 5 ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej lub HUVEC, na dołek na sześciodołkowych płytkach w pożywce VEGF i pozostaw je na noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w celu przyłączenia się. Przygotować kultury Porphyromonas gingivalis w infuzji mózgowo-sercowej lub pożywce BHI, jak opisano w załączonym tekście, i pozwolić kulturom osiągnąć fazę logarytmiczną, podczas gdy gęstość optyczna kultury przy 660 nanometrach waha się od 0,5 do 0,7.

Przenieś bakterie do 15-mililitrowej probówki i owiń kawałek parafilmu wokół nakrętki, aby zapobiec ekspozycji tlenowej. Następnie odwiruj bakterie z prędkością 5000 razy g przez 10 minut. Wewnątrz komory beztlenowej umyj granulowane bakterie beztlenowym PBS i ponownie odwiruj z prędkością 5,000 g przez 10 minut. Zawiesić bakterie w pożywce VEGF.

Aby zainfekować HUVEC Porphyromonas gingivalis, należy przenieść sześciodołkowe płytki z inkubatora do komory beztlenowej. Odessać pożywkę ze studzienek badawczych i przemyć trzykrotnie beztlenowym PBS.

Określić liczbę komórek z jednego reprezentatywnego dołka za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego. Następnie dodaj 2 mililitry na studzienkę beztlenowej pożywki VEGF i umieść płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze beztlenowym na 20 minut, aby uzyskać równowagę.

Określ gęstość optyczną bakterii i zawieś je ponownie w odpowiedniej objętości pożywki VEGF, aby zainfekować komórki przy wielokrotności infekcji wynoszącej 100 do 1 stosunek bakterii do komórek. Dodaj zawiesinę bakteryjną do komórek i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu infekcji. Do lizy komórek w komorze beztlenowej przygotuj roztwór saponin o zawartości 1% wagowo-objętościowej w pożywce BHI i przefiltruj przez filtr 0,2 mikrona.

Aby zbadać interakcje bakterii z komórkami gospodarza, wyjmij sześciodołkową płytkę z inkubatora i odessaj pożywkę infekcyjną. Przemyć trzykrotnie beztlenowym PBS. Następnie dodaj 2 mililitry roztworu saponin do każdej studzienki i inkubuj przez 15 minut, aby umożliwić lizę komórek.

Następnie zeskrob komórki z dna studzienki i rozcieńcz lizat komórkowy 1 do 1 pożywką BHI. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia, zaczynając od 1 do 100. Umieścić 200 mikrolitrów odpowiedniego rozcieńczenia na płytkach z agarem do krwi. Owiń płytki parafilmem i inkubuj je w inkubatorze beztlenowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni, aby umożliwić utworzenie kolonii. Następnie, za pomocą lightboxa, policz jednostki tworzące kolonie lub CFU na każdej płytce.