Wizualizacja zinternalizowanych bakterii beztlenowych w komórkach śródbłonka gospodarza

Zacznij od zawiesiny aktywnie rosnących Porphyromonas gingivalis, beztlenowych bakterii chorobotwórczych.

Dodaj BCECF-AM, niefluorescencyjny, przepuszczalny dla komórek barwnik.

Aktywne esterazy cytoplazmatyczne hydrolizują barwnik do fluorescencyjnej, nieprzepuszczalnej dla komórek formy, barwiąc bakterie.

wirówka. Ponownie zawiesić bakterie w podłożach beztlenowych.

Dodaj oznakowane bakterie do studzienek wielodołkowych zawierających szkiełka nakrywkowe z przylegającymi ludzkimi komórkami śródbłonka.

Inkubować w komorze beztlenowej.

Fimbie bakteryjne wiążą się z receptorami powierzchni komórek śródbłonka, inicjując wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne.

Prowadzi to do przegrupowania aktyny i internalizacji bakterii w fagosomach.

Po inkubacji umyj szkiełka nakrywkowe buforem w celu usunięcia niezinternalizowanych bakterii.

Utrwal komórki za pomocą paraformaldehydu, aby zachować struktury komórkowe. Przepuszczalność komórek za pomocą niejonowego detergentu, aby uzyskać dostęp do celów wewnątrzkomórkowych.

Dodaj znakowaną fluorescencyjnie falloidynę, która wiąże się z włóknami aktyny.

Umieść szkiełko nakrywkowe na podłożu montażowym zawierającym DAPI, które barwi DNA.

Obserwuj fluorescencyjne Porphyromonas gingivalis w komórkach śródbłonka za pomocą fluorescencyjnej aktyny, potwierdzając internalizację bakterii.

Aby uwidocznić zinternalizowane bakterie, najpierw aseptycznie przenieś autoklawowane szklane szkiełka nakrywkowe do każdej studzienki 12-dołkowej płytki. Na szkiełku nakrywkowym rozłożyć na płytki pięć razy po 10 do czterech HUVEC na basenie i inkubować przez 24 godziny. Aby oznaczyć bakterie, odwiruj bakterie w środkowej fazie logarytmicznej i ponownie zawieś osad za pomocą beztlenowego PBS. Ponownie odwirować i powtórzyć etap mycia.

Dodaj 20 mikrolitrów 0,2 milimolowego BCECF-AM do dwóch mililitrów beztlenowego PBS zawierającego od pięciu do siedmiu razy 10 do ósmej bakterii na mililitr. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w ciemności.

Używany przez nas barwnik fluorescencyjny może zabarwić większość bakterii beztlenowych. W związku z tym nie są wymagane żadne inne odczynniki, takie jak specyficzne przeciwciało.

Odwirować zawiesinę bakteryjną 5,000 razy g przez 10 minut, aby usunąć niezwiązany odczynnik do etykietowania i ponownie zawiesić bakterie w pożywce VEGF. Następnie zainfekuj komórki HUVEC w stosunku 100 do 1, bakterie do komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji usunąć pożywkę infekcyjną i trzykrotnie przemyć komórki PBS. Następnie dodaj 4% paraformaldehydu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby utrwalić komórki w komorze beztlenowej.

Wyjmij stałe komórki z komory, a następnie trzykrotnie umyj szkiełka nakrywkowe PBS. Inkubuj szkiełka nakrywkowe w jednym mililitrze 0,2% Triton X-100 przez 10 minut, aby przepuszczalność komórek. Następnie trzykrotnie umyj szkiełka nakrywkowe PBS. Teraz dodaj 50 mikrolitrów po 50 mikrogramów na mililitr falloidyny TRITC do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej, aby wybarwić komórkową oligomeryczną aktynę.

Po inkubacji trzykrotnie przemyć szkiełko nakrywkowe PBS. Odwrócić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym z miękko osadzonym medium montażowym zawierającym jeden mikrogram na mililitr DAPI do barwienia jądrowego. Następnie uszczelnij brzeg szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i obserwuj pod mikroskopem konfokalnym.