JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 4:29 min • July 8th, 2025
Rozpocząć od płytki wielodołkowej zawierającej zawiesinę Streptococcus pneumoniae.
Wprowadź przeciwciała ukierunkowane na bakteryjny antygen powierzchniowy, które oddziałują z bakteryjnymi antygenami powierzchniowymi. To pokrywa bakterie przeciwciałami, tworząc opsonizowane bakterie do rozpoznawania immunologicznego.
Wysiewaj studzienki neutrofilami pochodzącymi z ludzkich limfocytów krwi obwodowej, uzupełnionymi surowicą królika zawierającą białka dopełniacza.
Podczas inkubacji białka dopełniacza, takie jak C3b, osadzają się na powierzchni bakterii, co prowadzi do dodatkowego powlekania opsoniną na bakteriach opsonizowanych przeciwciałami - zwiększając rozpoznawanie bakterii przez neutrofile.
Specyficzne receptory powierzchniowe na neutrofilach oddziałują z opsoninami na bakteriach, ułatwiając wchłanianie bakterii przez fagocytozę.
Wewnątrz fagosomu neutrofile rozkładają pochłonięte bakterie, zmniejszając liczbę bakterii w buforze.
Po inkubacji umieść rozcieńczony roztwór kokultury na płytce z agarem z krwią, aby umożliwić poszczególnym bakteriom utworzenie kolonii.
Porównaj liczbę kolonii w bakteriach leczonych opsoniną z bakteriami nieleczonymi.
Mniejsza liczba kolonii leczonych opsoniną wskazuje na wyższe zabijanie bakterii, co sugeruje skuteczne zabijanie opsonofagocytarne.
Rozmrozić jedną tubkę bulionu bakteryjnego. Osadzaj bakterie w ilości 6 000 g przez dwie minuty i ponownie zawieś osad komórkowy w OBB w optymalnym rozcieńczeniu uzyskanym w poprzednim kroku. Odpipetować 10 mikrolitrów zawieszonego rozcieńczenia bakteryjnego na basenie na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej z okrągłym dnem. Następnie dodaj 20 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała lub leczenia farmakologicznego do każdej studzienki doświadczalnej w dwóch egzemplarzach.
W przypadku studzienek kontrolnych należy użyć 1X PBS lub OBB, w zależności od buforu użytego do studzienek uzdatniających. Potrząsać płytką do pobierania próbek z prędkością około 90 obr./min w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.
Aby zebrać komórki zróżnicowane pod kątem HL60, które są traktowane DMF trzy dni wcześniej, należy granulować komórki w ilości 500 razy g przez trzy minuty. Wyrzucić supernatant i przemyć osad co najmniej 10 mililitrami 1XPBS. Granuluj umyte komórki 500 razy g przez trzy minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w OBB.
Dodać sterylną, nierozcieńczoną surowicę młodego królika w końcowej objętości od jednej do pięciu. Po godzinnej hodowli bakteryjnej podziel każdą próbkę do zduplikowanych studzienek dla dwóch grup. Następnie dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny dopełniacza HL60 do każdego eksperymentalnego zestawu studzienek i 50 mikrolitrów OBB tylko do studzienek bakterii. Potrząsaj 96-dołkową płytką w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.
Aby pokryć próbki, rozcieńczyć każdą studzienkę OBB w końcowej objętości od jednego do pięciu tak, aby każda próbka miała objętość co najmniej 50 mikrolitrów. Następnie należy odpipetować 50 mikrolitrów każdej próbki bezpośrednio na wyznaczony obszar płytki do hodowli bakterii, zapewniając odpowiednie odstępy między próbkami. Przykryj próbki i pozostaw do wyschnięcia przez około 15 minut w temperaturze pokojowej.
Odwróć płytki i kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Alternatywnie, płytki hodowlane w słoikach beztlenowych, aby sprawdzić, czy warunki beztlenowe wpływają na wzrost bakterii lub kontrolować morfologię. Po całonocnej hodowli policz kolonie w każdym wyznaczonym obszarze próbki i przystąp do analizy danych, porównując liczbę żywych komórek w każdym zestawie z odpowiednimi kontrolami.
Najtrudniejszym aspektem ustanowienia tej techniki po raz pierwszy będzie prawdopodobnie optymalizacja początkowych CFU w stadzie bakteryjnym, a także zapewnienie skutecznego różnicowania komórek HL60.