Ocena zinternalizowanego Porphyromonas gingivalis w komórkach śródbłonka gospodarza

Podczas zakażenia Porphyromonas gingivalis fimbrie bakterii beztlenowych wiążą się ze specyficznymi receptorami na komórkach gospodarza.

To wiązanie inicjuje wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne, powodując przegrupowanie aktyny i internalizację bakterii w fagosomach.

Aby ocenić przeżywalność zinternalizowanego Porphyromonas gingivalis w komórkach śródbłonka in vitro, należy pobrać płytkę wielodołkową zawierającą komórki śródbłonka przylegające do szkiełek nakrywkowych.

Dodać zawiesinę Porphyromonas gingivalis. Inkubować, aby ułatwić internalizację bakterii.

Usuń pożywkę i umyj za pomocą buforu beztlenowego w celu usunięcia nieinternalizowanych bakterii.

Dodaj pożywkę zawierającą antybiotyki, nieprzepuszczalne dla komórek śródbłonka, aby wyeliminować bakterie przyczepione do powierzchni.

Inkubuj z łagodnym środkiem powierzchniowo czynnym, aby lizować komórki śródbłonka, uwalniając bakterie bez powodowania ich lizy.

Rozcieńczyć zebrany lizat pożywką. Przygotować seryjne rozcieńczenia lizatu.

Rozcieńczenia rozcieńczyć na płytkach z agarem z krwią. Inkubuj w warunkach beztlenowych, aby Porphyromonas gingivalis mógł rosnąć i tworzyć widoczne kolonie.

Policz kolonie, aby ocenić zdolność Porphyromonas gingivalis do inwazji i przetrwania w komórkach śródbłonka.

Po zakażeniu komórek HUVEC należy przemyć komórki trzykrotnie beztlenowym PBS. Następnie dodaj 2 mililitry pożywki VEGF uzupełnionej wstępnie zoptymalizowanymi stężeniami antybiotyków do komórek HUVEC. Inkubuj komórki przez godzinę. Odessać pożywkę i dodać 2 mililitry 1% roztworu saponin w BHI do każdej studzienki. Inkubować przez 15 minut.

Następnie zeskrob zlizowane komórki i zbierz lizat w probówce wirówkowej. Rozcieńczyć lizat w stosunku 1 do 1 pożywką BHI, a następnie przygotować seryjne rozcieńczenia, zaczynając od 1 do 100. Umieść 200 mikrolitrów o odpowiednich stężeniach na płytkach z agarem z krwią. Pozwól bakteriom rosnąć przez siedem dni w komorze beztlenowej, a następnie policz kolonie.