Barwienie cytometrią przepływową subpopulacji makrofagów zakażonych Mycobacterium tuberculosis

Zacznij od przylegających subpopulacji makrofagów M1 i M2, wyróżniających się specyficznymi markerami powierzchniowymi. Komórki te są zakażone znakowaną fluorescencyjnie prątką prątków gruźlicy.

Dodaj bufor FACS do studzienek hodowlanych.

EDTA w buforze umożliwia odłączenie komórek od studzienek hodowlanych.

Przenieść zawiesinę komórkową do probówek do mikrowirówek.

Odwirować probówki. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w sprzężonym z fluorochromem koktajlu przeciwciał anty-makrofagowych i barwniku żywotności, Zombie-UV.

Barwnik fluorescencyjny Zombie-UV wnika do martwych komórek przez uszkodzone błony i wiąże się z białkami cytoplazmatycznymi, umożliwiając wyraźne różnicowanie od żywotnych niebarwionych komórek.

Co więcej, sprzężone fluorescencyjnie przeciwciała anty-makrofagowe wiążą się z docelowymi antygenami na makrofagach, umożliwiając zróżnicowane wykrywanie subpopulacji.

Umyj komórki, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Wirówka. Usunąć supernatant.

Ponownie zawiesić komórki w buforze utrwalającym w celu sieciowania białek, zachowując morfologię komórek i dezaktywując prątki w celu bezpiecznego obchodzenia się z nimi podczas analizy.

Na koniec odwirować i przetworzyć próbki do cytometrii przepływowej.

Użyj odpowiedniej strategii bramkowania, aby określić procent subpopulacji zakażonych Mycobacterium.

Aby wybarwić komórki do cytometrii przepływowej, należy inkubować zakażone komórki z 1 mililitrem buforu FACS uzupełnionego 0,5 milimolowym EDTA na studzienkę przez co najmniej 30 minut. Pod koniec inkubacji zebrać oderwane komórki za pomocą delikatnego pipetowania i przenieść komórki do pojedynczych zakręcanych probówek do mikrowirówek w celu odwirowania.

Ponownie zawiesić komórki w około 50 mikrolitrach sprzężonego z fluorochromem koktajlu przeciwciał anty-ludzkich i barwnika żywotności będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.

Po umyciu utrwalić komórki 200 mikrolitrami świeżo przygotowanego buforu utrwalającego przez 30 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Po utrwaleniu i umyciu ponownie zawieś komórki w 400 mikrolitrach buforu FACS i przenieś komórki do 1-mililitrowych probówek wirówek.

Aby przeanalizować komórki, użyj kulek kompensacyjnych, aby skompensować sygnał fluorescencyjny dla każdego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem w koktajlu i użyj niebarwionych komórek, aby ustawić bramę dla ujemnej populacji komórek. Następnie należy pobrać co najmniej 50 000 komórek na próbkę.