Test in vitro do badania zdolności cytotoksycznych komórek zabójczych indukowanych cytokinami

Weźmy hodowlę komórek rakowych z fluorescencyjnie znakowanymi białkami cytoplazmatycznymi.

Dodaj indukowane cytokinami komórki zabójcze lub CIK - efektorowe limfocyty T o cechach podobnych do komórek NK - posiadające aktywność przeciwnowotworową.

Receptory D lub NKG2D grupy 2 NKG2D na komórkach CIK wiążą się z białkami indukowanymi stresem na komórkach nowotworowych.

Wiązanie indukuje komórki CIK do uwalniania toksyn cytoplazmatycznych granulek - perforyn i granzymów.

Perforyny tworzą pory w błonie komórkowej raka, umożliwiając wnikanie granzymów, które aktywują kaspazy, indukując apoptozę.

Po inkubacji zbierz komórki. Dodaj fluorescencyjny barwnik żywotności komórek wiążący kwas nukleinowy.

Barwnik dostaje się przez uszkodzoną błonę komórkową i wiąże się z DNA, w wyniku czego martwe komórki są podwójnie zabarwione.

Przy nienaruszonej błonie komórkowej żywe komórki są nieprzepuszczalne dla barwnika.

Przepuść komórki przez cytometr przepływowy, aby wykryć żywe komórki wykazujące pojedynczą fluorescencję i martwe komórki z podwójną fluorescencją.

Utwórz wykres punktowy, aby zmierzyć procent martwych komórek rakowych, określając ilościowo działanie cytotoksyczne komórek CIK.

Aby przeprowadzić test cytotoksyczny, należy przeprowadzić wspólną hodowlę CIK i ludzkich komórek K562 przewlekłej białaczki szpikowej, dodając 1 mililitr komórek K562 do każdej studzienki na 6-dołkowej płytce o gęstości 0,5 miliona komórek na mililitr. Następnie dodaj 1 mililitr podłoża podstawowego z komórkami CIK lub bez komórek CIK do płytki 6-dołkowej, zgodnie z podaniem w protokole tekstowym. Wymieszać zawiesiny komórek, delikatnie pipetując w górę i w dół co najmniej trzy razy.

Umieść płytkę w inkubatorze na 24 godziny. Teraz należy przeprowadzić wspólną hodowlę komórek CIK i OC-3 jajnika, dodając 1 mililitr podłoża podstawowego z komórkami CIK lub bez nich do płytki 6-dołkowej, zgodnie z protokołem tekstowym. Wymieszać zawiesiny komórek, delikatnie pipetując w górę i w dół co najmniej trzy razy za pomocą ostrza w inkubatorze przez 24 godziny. Po inkubacji zbierz zawiesinę komórek CIK-K562 bezpośrednio do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Aby zebrać zarówno zawiesinę, jak i przylegające komórki z grup CIK-OC-3, najpierw przenieś zawiesinę komórek do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Umyj studzienkę 1 mililitrem sterylnego PBS. Zbierz PBS i dodaj go do probówki. Następnie dodaj 0,5 mililitra roztworu enzymu dysocjacji komórek i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dodaj 1 mililitr roztworu z tej samej probówki do odpowiedniego dołka i delikatnie wymieszaj komórki, pipetując w górę iw dół co najmniej trzy razy za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 mililitra. Zbierz wszystkie komórki w tej samej probówce. Wirować przy 300 x g przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 mililitrze sterylnego PBS. Granulować komórki o gramaturze 300 x g przez 10 minut. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach sterylnego PBS.

Dodaj 5 mikrolitrów barwnika 7-AAD do zawiesiny komórek. Delikatnie wymieszaj komórki, pipetując w górę i w dół co najmniej trzy razy za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 mililitra. Inkubować przez 10 minut i pozostawić w ciemności przed analizą.

Aby wykonać test zdolności cytolitycznych, wymieszaj zawiesinę komórek i powtórz przygotowanie do cytometrii przepływowej. Kliknij przycisk Nowa próbka, aby dodać próbkę i probówkę do eksperymentu. Nazwij probówki zgodnie z listą w protokole tekstowym.

Aby utworzyć system bramkowania rozproszonego dla testu cytolitycznego, najpierw wybierz Rurkę 1 i kliknij przycisk Wykres punktowy. Aby utworzyć wykres FSC-A/SSC-A, narysuj bramkę prostokąta nad wszystkimi zdarzeniami o progu FSC-A większym niż 50 000, aby wykluczyć szczątki komórek. Wybierz parametr SSC-A/CFSE dla nowego wykresu kropkowego. Następnie wybierz parametr 7-AAD/CFSE dla nowego wykresu kropkowego i narysuj bramkę czterokwadrantową, aby zdefiniować cztery subpopulacje.

Kliknij przycisk Załaduj próbkę, aby najpierw przeanalizować ślepą próbkę kontrolną. Dostosuj napięcie SSC-A i FSC-A. Zidentyfikuj populację martwych komórek przy użyciu parametrów kanału CFSE i 7-AAD. Rejestruj dane z ponad 20 000 komórek CFSE dodatnich w każdej próbce. Otwórz pliki zawierające wartości statystyczne każdej pojedynczej próbki, aby przeanalizować populacje komórek niezdolnych do życia, a następnie wyeksportuj dane do plików analizy.