JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:40 min • July 8th, 2025
Weź komórki białaczkowe w pożywkach wzrostowych bez czynników stymulujących, takich jak cytokiny, i inkubuj je.
Brak czynników stymulujących pozwala wewnątrzkomórkowym fosforylowanym białkom na defosforylację i powrót do swoich rodzimych stanów.
Odwirować i usunąć pożywkę. Ponownie zawieś komórki w supernatance zrębu zawierającej cytokinę, limfopoetynę zrębu grasicy lub TSLP.
TSLP wiąże się ze swoim receptorem na komórce białaczkowej, wywołując dimeryzację receptora.
To zbliża do siebie dwie kinazy związane z Janusem lub JAK, ułatwiając wzajemną transfosforylację .
Aktywowane JAK fosforylują ogony cytoplazmatyczne receptora, tworząc miejsca dokowania dla przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji, monomerów STAT.
Po fosforylacji STAT dimeryzują i odłączają się od receptora, aby regulować dalsze procesy komórkowe.
Napraw komórki, aby utrzymać stany fosforylacji białek wewnątrzkomórkowych.
Potraktuj komórki roztworem przepuszczalności, aby zwiększyć przepuszczalność błony komórkowej.
Dodaj przeciwciała znakowane fluorescencyjnie, aby oznaczyć fosforylowane białka.
Pomiar sygnału fluorescencji metodą cytometrii przepływowej koreluje z fosforylacją STAT indukowaną przez TSLP.
Aby zwalidować supernatant wytworzony ze zmodyfikowanego zrębu, rozmrozić próbki supernatantu pobrane z kontroli w zrębie z ekspresją cytokin i umieścić 3 dołki linii komórkowych białaczki na stan w pożywce R20 przy stężeniu 2 razy 10 do piątych komórek na studzienkę na 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Inkubuj komórki przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić utratę fosforylacji z ich poprzedniej hodowli.
Następnie przenieś komórki z każdej studzienki do pojedynczych 4-mililitrowych probówek i zbierz komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić granulki w 600 mikrolitrach na warunki eksperymentalne i rozlać 200 mikrolitrów komórek na studzienkę dla każdego warunku w trzech egzemplarzach. Inkubować komórki przez odpowiedni okres zgodnie ze specyficznym komercyjnym testem fosfologicznym.
Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie i znakować komórki za pomocą barwienia cytometrią fosfoprzepływową zgodnie z protokołem producenta. Następnie przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu standardowych protokołów analizy cytometrii przepływowej, aby sprawdzić, czy cytokina w supernatance zrębu fosforyluje komórki białaczkowe.