Wizualizacja bakterii w skrawkach biopsji pęcherza moczowego za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Rozpocznij od szklanego szkiełka zawierającego odparafinowany i ponownie uwodniony zakażony wycinek tkanki biopsji pęcherza moczowego zawierający bakterie uropatogenne.

Wprowadź znakowane fluorescencyjnie sondy uniwersalne - komplementarny jednoniciowy oligonukleotyd specyficzny dla konserwatywnego regionu bakteryjnego 16s rybosomalnego RNA lub 16s-rRNA.

Inkubuj szkiełko w ciemności w podwyższonej temperaturze, aby uzyskać optymalną hybrydyzację.

Podczas inkubacji sondy hybrydyzują wyłącznie z konserwatywnym regionem na bakteryjnym 16s-rRNA, nadając bakteriom zieloną fluorescencję.

Po hybrydyzacji przemyć wstępnie podgrzanym buforem, aby usunąć niezwiązane sondy.

Wybarwić wycinek tkanki barwnikiem Hoechst i znakowanymi fluoroforem markerami białek komórkowych.

Cząsteczki Hoechst wiążą się z DNA, barwiąc jądra na niebiesko, podczas gdy markery znakowane fluoroforem oddziałują z określonymi składnikami komórki, takimi jak włókna mucyny i aktyny, nadając czerwoną fluorescencję w sekcji biopsji.

Umyj szkiełko i dodaj pożywkę montażową do sekcji chusteczek.

Pod mikroskopem konfokalnym zielona fluorescencja w sekcji biopsji pęcherza moczowego z czerwoną fluorescencją potwierdza obecność bakterii związanych z tkanką.

Przygotuj komorę nawilżającą dla każdej sondy, dodając namoczoną, pogniecioną, delikatną chusteczkę roboczą i sterylną wodę do zbiornika pudełka na końcówki P1000. Umieść wkład z uchwytem końcówki na górze, ponieważ tam będą znajdować się szkiełka. Po zakończeniu końcowego mycia wyjmij szkiełko z rusztu na suwaki i umieść je na świeżym ręczniku papierowym, chusteczką do góry. Użyj delikatnej chusteczki do wysuszenia szkiełka, uważając, aby delikatnie przetrzeć tylko w pobliżu, ale nie w sekcję biopsji, aby odprowadzić wodę. Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj obwódkę wokół sekcji biopsji i umieść szkiełko chusteczką do góry w komorze nawilżającej.

Następnie umieść komorę nawilżającą w inkubatorze ustawionym na 50 stopni Celsjusza. Odpipetować od 50 do 150 mikrolitrów roztworu barwiącego bezpośrednio na chusteczkę, tak aby prostokąt utworzony przez hydrofobową obwódkę wokół tkanki został wypełniony i delikatnie zamknąć pudełko. Inkubować przez noc w temperaturze 50 stopni Celsjusza w ciemności. Jeśli inkubator ma okno, przykryj je folią aluminiową, aby stworzyć ciemne otoczenie.

Następnego ranka wyjmij szkiełka z komór nawilżających i szybko usuń pozostały roztwór hybrydyzacyjny delikatną ściereczką zadaniową. Następnie umieść szkiełka w pionowym stojaku do barwienia. Umieść ruszt do barwienia w owiniętym folią aluminiową słoiku coplin zawierającym 100 ml podgrzanego buforu do mycia na 10 minut. Powtórz ten krok mycia jeszcze dwa razy ze świeżym buforem do mycia w nowych słoikach z kopiną.

Podczas tych etapów płukania należy przygotować barwnik przeciwbarwiący, rozcieńczając roztwór podstawowy Hoechst 33342 w buforze do płukania w stosunku 1 do 1 000. Do tej samej probówki dodaj aglutyninę z kiełków pszenicy Alexa-555 do końcowego stężenia pięciu mikrogramów na mililitr i falloidynę Alexa-555 do końcowego stężenia 33 nanomolowców. Przechowywać w ciemności, aż będzie gotowy do użycia.

Po zakończeniu końcowego mycia wyjmij szkiełka ze słoika z kopinem i delikatnie usuń nadmiar buforu do mycia delikatną ściereczką zadaniową. Umieść szkiełka chusteczką do góry na ręczniku papierowym i dodaj od 50 do 150 mikrolitrów barwnika przeciwdziałającego bezpośrednio na chusteczkę, tak aby hydrofobowa granica była wypełniona, ale nie przelewała się. Przykryj do czterech szkiełek pokrywką cryobox i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Następnie umieść szkiełka z powrotem w stojaku do barwienia i umyj je jeszcze dwukrotnie w słoikach z kopiną zawierających świeży bufor do mycia, przy czym każde mycie trwa 10 minut. Następnie dokładnie osusz szkiełka i połóż je chusteczką do góry na ręczniku papierowym pod wierzchem krioboxu. Wyciśnij jedną kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na chusteczkę i delikatnie umieść na niej szkiełko nakrywkowe o odpowiedniej wielkości. Delikatnie wyciśnij wszelkie pęcherzyki i pozwól szkiełkom z nakrywką utwardzić się przez noc w ciemności. Następnego dnia uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych do szkiełka cienką warstwą przezroczystego lakieru do paznokci i pozostaw do wyschnięcia w ciemności na 10 minut, a następnie przechowuj je w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Gdy będziesz gotowy do zobrazowania barwionych biopsji, włącz mikroskop konfokalny i oprogramowanie powiązane z mikroskopem. Zacznij od slajdu FISH-positive i przejdź do trybu wizualizacji komputerowej. Wybierz kanały dla 405, 488 i 555. Ustaw otwór przy użyciu najdłuższego kanału o długości fali, którym w tym przypadku jest 555. Następnie znajdź aktualną płaszczyznę ogniskową do wizualizacji oznakowanych bakterii w kanale 488. Nie zmieniając płaszczyzny ogniskowej, ustaw wzmocnienie, moc lasera i przesunięcie dla każdego kanału, tak aby sygnał nie był nasycony, a tło nie było nadmiernie korygowane. Uzyskaj obraz we wszystkich trzech kanałach.