Technika in vitro do wytwarzania apoptotycznych limfocytów T za pośrednictwem promieniowania UV

Weź zawiesinę komórek Jurkata - komórek białaczki limfocytów T.

Zmieszać podwielokrotność z barwnikiem żywotności komórek i zapewnić odpowiednią liczbę żywych komórek.

Umieść komórki w naczyniu hodowlanym i zastosuj promieniowanie ultrafioletowe C lub UVC przez wymagany czas.

UVC przenika do komórek i jest absorbowane przez DNA, tworząc fotoprodukty pirymidynowe.

Po napromieniowaniu inkubować komórki. Rozległe uszkodzenie DNA za pośrednictwem UVC inicjuje wewnętrzny szlak apoptozy, aktywując białka proapoptotyczne na zewnętrznej błonie mitochondrialnej.

Aktywowane białka oligomeryzują, tworząc pory błonowe i uwalniając cytochrom C z przestrzeni międzybłonowej do cytoplazmy.

Kompleksy cytochromu C z czynnikiem aktywującym proteazę apoptozy-1, tworząc kompleks apoptosomyczny. Apoptosom aktywuje kaspazy, powodując apoptozę.

Wprowadź znakowaną fluoroforem anektynę V, aby oznaczyć fosfatydyloserynę na błonie, marker komórek apoptotycznych, i dodaj jodek propidyny, który dostaje się przez uszkodzoną błonę, aby oznaczyć DNA.

Za pomocą cytometrii przepływowej oznacz wczesne komórki apoptotyczne znakowane apoltozą anektyną V i podwójnie barwione późne komórki apoptotyczne.

Rozpocznij od hodowli limfocytów T Jurkat w pożywce do hodowli komórek podstawowych, uzupełnionej zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Limfocyty T Jurkata to zawiesinowa linia komórkowa, którą można utrzymać poprzez pasażowanie do wstępnie podgrzanych pożywek hodowlanych co trzy dni.

Przygotuj komórki apoptotyczne, hodując je do 90% zbieżności, co trwa od trzech do czterech dni po pasażowaniu. Hoduj komórki w pięciu kolbach T75, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do tego protokołu. Gdy komórki będą gotowe, odessać zawartość kolby o pojemności około 24 mililitrów i przenieść ją do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru.

Osadzać komórki przez odwirowywanie w ilości 271 razy g przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Następnie ponownie zawieś komórki w pożywce, aby uzyskać trzy miliony komórek na mililitr. Podziel komórki na szalki do hodowli tkankowych o wymiarach 100 na 20 milimetrów, przenosząc pięć mililitrów komórek na szalkę.

Przygotuj około dziewięciu potraw kulturowych. Odłóż jedno naczynie na bok jako nienaświetloną kontrolę, a pozostałe naczynia wystaw na działanie promieniowania UV. Ustaw sieciownik UV na odpowiedni poziom energii, naciskając przycisk energii i wpisując "600" za pomocą klawiatury numerycznej. Napromieniuj wszystkie naczynia komórkami z wyjątkiem kontroli, pamiętając o zdjęciu górnej pokrywy naczynia do hodowli tkankowej podczas ekspozycji na promieniowanie UV.

Następnie inkubuj wszystkie szalki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez cztery godziny. Po inkubacji połącz wszystkie napromieniowane komórki w 50-mililitrową stożkową probówkę i osadzaj je przez odwirowanie 271 razy g przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 24 mililitrach sterylnego PBS. Ponownie odwirować probówkę i usunąć supernatant.