Śledzenie leukocytów w oparciu o fotokonwersję u transgenicznego danio pręgowanego zakażonego bakteriami

0 views • 4:02 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zacznij od naczynia zawierającego osadzone w agarozie, znieczulone, transgeniczne larwy danio pręgowanego, wyrażające fotokonwertowalne białko fluorescencyjne w swoich leukocytach - fagocytarnych komórkach odpornościowych.

Lewy pęcherzyk uszny, wstępnie wstrzyknięty bakteriami znakowanymi czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym, jest umieszczony płasko na dnie naczynia.

W obrębie pęcherzyka usznego wstępnie wstrzyknięte bakterie powodują miejscową infekcję, wywołując migrację komórek odpornościowych i uwalnianie chemokin, powodując infiltrację leukocytów do pęcherzyka usznego.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym obserwuj początkową rekrutację zielonych leukocytów i fagocytozę czerwonych bakterii przez leukocyty w miejscu infekcji.

Oświetl pęcherzyk uszny falą o długości fali 405 nanometrów, nieodwracalnie przekształcając fotokonwertowalne białko fluorescencyjne z zielonego na czerwone i nadając czerwoną fluorescencję leukocytom - umożliwiając ich wyraźną wizualizację i precyzyjne śledzenie.

Teraz zbadaj larwy na dwóch różnych długościach fal na różnych głębokościach, umożliwiając wizualizację zarówno fotokonwertowanych czerwonych, jak i pozostałych leukocytów zielonej fluorescencji.

Fotokonwertowane czerwone leukocyty rozpraszają się z pęcherzyków usznych i rozpraszają się po całym ciele, ułatwiając śledzenie leukocytów oparte na fotokonwersji.

Po przygotowaniu agarozy z trikainą zgodnie z protokołem tekstowym na stoliku mikroskopu stereoskopowego, za pomocą pipety transferowej umieścić cztery do pięciu znieczulonych larw w naczyniu ze szklanym dnem. Usuń roztwór trikainy i agarozy z łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 1 do 2 minut.

W międzyczasie usuń jak najwięcej płynu ze znieczulonych larw. Następnie wlej schłodzoną agarozę do naczynia, aż pokryjesz około połowy powierzchni. Następnie zakręć naczyniem, aby rozprowadzić agarozę. Podnieś larwy, które wypłynęły na boki naczynia i odpipetuj je z powrotem do środka. Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, użyj długiej końcówki pipety, aby delikatnie ustawić larwy zgodnie z życzeniem.

Aby zobrazować pęcherzyk uszny, należy ustawić larwy tak, aby prawy pęcherzyk uszny był skierowany do góry, a lewy pęcherzyk uszny przylegał płasko do dna naczynia. Pozwól agarozie ostygnąć przez około 10 minut przed przeniesieniem naczynia. Następnie delikatnie odpipetuj trochę trykainy i roztworu E3 na wierzch warstwy agarozy, aby była wilgotna.

Aby zwizualizować próbki, użyj skanowania stosu z laserami 488 i 543 nm. Użyj ciągłego skanowania linii, aby dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora. Sprawdź, czy nie ma przypadkowo fotokonwertowanej czerwonej fluorescencji. W oknie "Kontrola akwizycji obrazu" w sekcji "Ustawienia bodźca" wybierz narzędzie "Użyj skanera" i wybierz "Główny". Wybierz laser 405 nm i ustaw go na 70% mocy. Następnie, korzystając z opcji okręgu, zdefiniuj obszar zainteresowania w pęcherzyku usznym.

W ustawieniu "Rozpoczęcie bodźca" wybierz "Aktywacja szeregowo" z wstępną aktywacją 1 klatki i czasem aktywacji 60 000 milisekund. W oknie "Ustawienia akwizycji", pod nagłówkiem "Skanowanie czasu", wybierz dwa interwały minutowe, każdy dla konwersji przed i jeden po konwersji zdjęcia. Rozpocznij serię poklatkową, aby zainicjować fotokonwersję zdefiniowanego obszaru zainteresowania. Na koniec zeskanuj próbkę za pomocą stosu z oraz laserów 488 i 543 nm, aby uwidocznić fotokonwertowaną czerwoną fluorescencję, a także pozostałą zieloną fluorescencję.

08:52

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Related Videos

0 Views

09:13

Opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku Clostridioides difficile

Related Videos

0 Views

09:42

Zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami Aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen

Related Videos

0 Views

10:31

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznego danio pręgowanego: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez celowaną ablację komórek neuronalnych

Related Videos

0 Views

07:53

Mapowanie losu pojedynczej komórki u danio pręgowanego

Related Videos

0 Views

11:18

Zakażenie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Related Videos

0 Views

07:19

Śledzenie komórek za pomocą białek fotokonwertowalnych podczas rozwoju danio pręgowanego

Related Videos

0 Views

11:16

Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

Related Videos

0 Views

07:59

Śledzenie komórek u danio pręgowanego transgenicznego GFP za pomocą fotokonwertowalnego systemu PSmOrange

Related Videos

0 Views

09:49

Fotokonwersja jednokomórkowa u żyjących nienaruszonych danio pręgowanych

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026