Technika ekstrakcji kwasów nukleinowych z krwi za pośrednictwem cząstek szkła magnetycznego

Weź probówkę zawierającą świeżo pobraną ludzką krew i dodaj bufor do lizy.

Detergent w buforze przenika przez błonę komórkową, lizuje komórki i uwalnia wewnątrzkomórkowe kwasy nukleinowe lub NA i nukleazy.

Czynniki chaotropowe w buforze denaturują nukleazy, zapobiegając degradacji NA.

Dodaj cząsteczki szkła magnetycznego lub MGP - cząstki magnetyczne pokryte krzemionką - i dokładnie wymieszaj.

Niskie pH buforu protonuje krzemionkę, pozostawiając ładunek dodatni na powierzchni MGP.

Ujemnie naładowane NA wiążą się elektrostatycznie z naładowaną powierzchnią, tworząc kompleks NA-MGP.

Pod wpływem pola magnetycznego kompleksy NA-MGP gromadzą się z boku rury.

Odrzucić sklarowany osad zawierający szczątki komórkowe i białka.

Wykonać wiele etapów mycia, ponownie zawieszając kompleksy NA-MGP w buforze do mycia, stosując pole magnetyczne do zbierania kompleksów i odrzucając supernatant wraz z pozostałymi zanieczyszczeniami.

Zawiesić kompleksy w buforze elucyjnym. Wysokie pH zakłóca interakcję NA-MGP, uwalniając NA. Wymyte NA są gotowe do dalszych testów.

Aby oczyścić kwasy nukleinowe z pobranej krwi, ponownie wymieszaj zawartość probówki, obracając rurkę próżniową ręcznie od 5 do 10 razy. Wlać przygotowaną porcję MGP bezpośrednio do probówki do pobierania krwi, a następnie umieścić nową pokrywkę z niewykorzystanej probówki do pobierania krwi na probówce zawierającej próbkę. Umieść palec na pokrywce, aby upewnić się, że probówka jest szczelnie zamknięta, i wymieszaj zawartość tubki, obracając ją od 5 do 10 razy.

Umieść probówkę w uchwycie magnetycznym i przytrzymaj palec na pokrywie, aby upewnić się, że rurka jest szczelnie zamknięta. Następnie kilkakrotnie obróć uchwyt magnetyczny z rurką, aby rozproszyć MGP, zanim zgromadzą się z boku rurki z magnesem. Zdejmij pokrywkę probówki i wyrzuć zawartość probówki do 50-mililitrowej probówki zbiorczej za pomocą jednorazowej pipety.

Wlać przygotowaną porcję WB1 bezpośrednio do probówki do pobierania krwi i zamknąć pokrywkę probówki. Wymieszaj zawartość ręcznie od 5 do 10 razy. Następnie zbierz kulki z boku rurki za pomocą magnesu i usuń płyn jak poprzednio. Ponownie zawiesić koraliki w przygotowanej podwielokrotności WB2. Następnie odrzucić roztwór i powtórzyć procedurę z przygotowaną podwielokrotnością WB3.

Na koniec wyjmij probówkę z uchwytu magnetycznego i wlej przygotowaną porcję EB bezpośrednio do probówki do pobierania krwi. Umieść pokrywkę na tubie i ponownie zawieś MGP, stukając palcem od 5 do 10 razy. Na koniec użyj jednorazowej pipety o pojemności 1,5 mililitra, aby przenieść jedną kroplę zawieszonych MGP do dalszej mieszaniny reakcyjnej amplifikacji kwasów nukleinowych.