Obrazowanie w superrozdzielczości tworzenia synaps immunologicznych komórek NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej

Przygotować szkiełko komorowe z podpartą dwuwarstwą lipidową lub SLB, złożoną z fosfolipidów i biotynylowanych fosfolipidów.

Dodaj białka blokujące, aby zapobiec niespecyficznym interakcjom.

Wprowadzić streptawidynę, która wiąże się z biotynylowanymi fosfolipidami.

Dodać biotynylowane, znakowane fluorescencyjnie przeciwciała anty-CD16, które wiążą się z unieruchomioną streptawidyną.

Odpipetować D-biotynę, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu streptawidyny z komórkami.

Wprowadź komórki NK lub natural killer. Receptory CD16 na tych komórkach specyficznie wiążą się z przeciwciałami anty-CD16 związanymi z SLB, tworząc synapsę immunologiczną.

To wiązanie wyzwala przegrupowanie aktyny i polaryzację mikrotubul, ostatecznie tworząc mikroklastry w centrum synapsy zawierające przeciwciała anty-CD16 związane z SLB i receptory CD16.

Granulki lityczne zawierające perforynę polaryzują i przenikają przez włókna aktyny w synapsie.

Napraw komórki. Przepuszczalność membran i SLB.

Dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciała falloidyny i antyperforyny, które wiążą się odpowiednio z filamentami aktyny i perforyną.

Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o super rozdzielczości zwizualizuj rozkład fluorescencyjnych włókien aktynowych i granulek perforynowo-dodatnich w synapsie.

Aby złożyć szklaną płaską dwuwarstwę lipidową, najpierw przygotuj 100 mililitrów roztworu piranii, mieszając 30% nadtlenku wodoru z kwasem siarkowym w stosunku 1 do 3 w zlewce. W tym roztworze umieść dwa prostokątne szkiełka nakrywkowe #1.5 na 20 do 30 minut. Podczas czyszczenia szkiełek nakrywkowych należy pobrać jedną tubkę wcześniej przygotowanych 400-mikromolowych lipidów DOPC i jedną tubkę wcześniej przygotowanych 80-mikromolowych lipidów Biotyna-PE. Transportuj je na lodzie do zbiornika argonu.

Po odtlenieniu nowej probówki do mikrowirówki argonem, dodaj DOPC i Biotin-PE w stosunku 1 do 1. Konkretna objętość będzie się różnić w zależności od potrzeb eksperymentalnych, ale powinna wynosić co najmniej 2 mikrolitry każdy. Odtlenić probówkę z mieszaniną i poszczególne probówki z odczynnikiem przed włożeniem ich z powrotem do lodówki.

Po zakończeniu czyszczenia dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu na kilka minut. Następnie pobrać 1,5 mikrolitra mieszaniny liposomów i podać ją w jednej kropli do jednej z komór pasowych szkiełka komorowego. Użycie dwóch kropli na linię jest typowe, ale nie jest konieczne.

Teraz szybko i sprawnie umieść suche szkiełko nakrywkowe na kropelkach. Upewnij się, że krople są wystarczająco oddalone od siebie, aby nie łączyły się po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego. Ponadto upewnij się, że krople pozostają okrągłe i dobrze zdefiniowane, nie dotykając krawędzi ścianek komory. Mocno dociśnij pomiędzy każdym pasem ruchu i wokół niego, aby zapewnić wodoszczelne uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem nakrywkowym.

Zaznacz pozycje kropli za pomocą markera. Następnie przepuść 100 mikrolitrów wodnej 5% kazeiny przez komorę, aby zablokować dwuwarstwę. Spróbuj upewnić się, że w komorze przepływowej nie ma pęcherzyków. Następnie wstrzyknij 100 mikrolitrów streptawidyny w stężeniu 333 nanogramów na mililitr do każdego pasa.

Po inkubacji przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej przemyć, przepuszczając 3 mililitry soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES z 1% albuminą surowicy ludzkiej przez każdy pas, aby usunąć nadmiar streptawidyny. Dodać 100 mikrolitrów biotynylowanego, znakowanego fluorescencyjnie anty-CD16 o wcześniej ustalonym stężeniu białka, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Po inkubacji w ciemności przez 20 do 30 minut, przemyć ponownie, przepuszczając 3 mililitry soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES z 1% albuminą surowicy ludzkiej przez każdy pas. Następnie przepuść przez komorę 100 mikrolitrów D-biotyny o stężeniu 25 nanomolowym, aby związać nadmiar streptawidyny, a tym samym wyeliminować szansę na niespecyficzne wiązanie streptawidyny z komórkami.

Następnie policz ludzkie komórki NK i ponownie zawieś je w stężeniu 500 000 na mililitr w soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES z 1% albuminą ludzkiej surowicy. Wypłucz D-biotynę z komory kolejnymi 3 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES z 1% albuminą surowicy ludzkiej na pas. Po ponownym zawieszeniu komórek w żądanym stężeniu dodaj 100 mikrolitrów do każdego pasa. Umieść komorę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 30 do 60 minut.

Po tym okresie inkubacji utrwal komórki 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 10 do 20 minut. Przemyć, przepuszczając 3 mililitry soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez każdy pas, aby usunąć paraformaldehyd. Następnie dodaj 400 mikrolitrów buforu blokującego przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie wybarwić F-aktynę i perforynę, dodając 200 mikrolitrów rozcieńczonego, znakowanego fluorescencyjnie falloidyny i znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała monoklonalnego antyperforyny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę przed myciem, przepuszczając przez komorę 3 mililitry soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Komora jest gotowa do obrazowania.

Aby rozpocząć, włącz wszystkie niezbędne moduły sprzętowe mikroskopu SED. Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu i włącz zarówno skanowanie rezonansowe, jak i moduły SED. Po dokonaniu tych wyborów poczekaj około trzech do pięciu minut, aż oprogramowanie się zainicjuje.

Kliknij zakładkę Konfiguracja u góry ekranu. Wybierz opcję Laser Config (Konfiguracja lasera). Następnie włącz białe światło i lasery STED 592-nanometrowe. Wybierz obiektyw 100X i wyrównaj wiązkę lasera wzbudzenia z laserem zubożającym o długości 592 nm. Wybierz moduł Laser Config (Konfiguracja lasera). Wyłącz laser zubożający 592 i włącz laser zubożający 660 nm.

Umieść szkiełko na stoliku nad obiektywem. Ustaw ostrość komórek związanych na wyznaczonym obszarze dwuwarstwowym za pomocą lampy światła białego i okularów. Następnie wróć do karty Pozyskiwanie bezpośrednio po prawej stronie karty Konfiguracja. Kliknij kartę Przełącz na światło białe, a następnie włącz ten moduł i przeciągnij linię lasera wzbudzenia na odpowiednią długość fali.

Po wybraniu żądanego detektora i ustawieniu zakresu wykrywania, kliknij przycisk Sekwencyjny na pasku narzędzi po lewej stronie, aby wyświetlić okno dialogowe skanowania sekwencyjnego u dołu lewego paska narzędzi. Dzięki temu użytkownik może dodać wiele sekwencji, z których każda ma inną wiązkę wzbudzenia dla innego koloru. Klikaj między ramkami, a następnie ustaw częstotliwość wzbudzenia, detektor i zakres wykrywania dla każdego dodatkowego koloru. Po zoptymalizowaniu wszystkich ustawień naciśnij Start, aby rozpocząć proces pozyskiwania.