JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 2:40 min. • July 8th, 2025
Zacznij od osadu komórkowego zawierającego komórki NK lub komórki NK oraz fluorescencyjnie wybarwione komórki docelowe.
Zawiesić osad w odpowiednim podłożu i inkubować.
Komórka NK oddziałuje poprzez białka adhezyjne powierzchniowe, tworząc synapsę immunologiczną z komórką docelową.
To inicjuje sygnalizację komórek NK, uwalniając cytotoksyczne granulki zawierające perforynę i granzymy do synapsy.
Perforyna, białko tworzące pory, tworzy kanały w błonie komórki docelowej, umożliwiając granzymom przedostanie się do cytoplazmy.
Granzyme, proteaza serynowa, oddziałuje z białkami wewnątrzkomórkowymi, aktywując szlak apoptozy w komórce docelowej.
Teraz dodaj barwnik fluorescencyjny jodku propidyny.
Barwnik dostaje się do martwych komórek przez ich uszkodzone błony i wiąże się z DNA poprzez interkalację między jego parami zasad.
W konsekwencji martwe komórki wyrażają podwójny fluorochrom, podczas gdy żywe komórki wyrażają pojedynczy fluorochrom.
Próbka jest gotowa do cytometrii przepływowej w celu oceny cytotoksyczności wywołanej przez komórki NK poprzez ilościowe określenie liczby martwych i żywych komórek docelowych.
Aby przygotować próbkę do badania cytotoksyczności, najpierw oznacz 1,5-mililitrowe probówki dla każdej próbki i / lub uczestnika, jeśli to konieczne, i pipetuj pożądany stosunek komórek NK i komórek K562 znakowanych DiO do każdej probówki.
Zebrać komórki przez odwirowanie i ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Następnie ponownie zawieś mieszaninę komórek w 500 mikrolitrach niekompletnego podłoża komórkowego NK i oznacz komórki w każdej probówce 5 mikrolitrami jodku propidyny.
Zbierz komórki przez kolejne odwirowanie i inkubuj zimną kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Pod koniec inkubacji odwirować komórki w tych samych warunkach wirowania i ponownie zawiesić osad w 25 mikrolitrach świeżej i kompletnej pożywki do hodowli komórek NK.