JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:10 min. • July 8th, 2025
Weźmy płytkę wielodołkową zawierającą precyzyjnie wycięte ludzkie plastry płuc, które utrzymują natywną mikroarchitekturę płuc.
Usuń nośnik. Dodać do studzienek zwiększające stężenie badanego czynnika i przeprowadzić inkubację.
W zależności od swojego potencjału cytotoksycznego, badany czynnik rozrywa błony komórkowe, wywołując śmierć komórki i redukując żywotne komórki w obrębie plastrów.
Po inkubacji usuń pożywkę. Zanurz plastry w pożywce zawierającej rozpuszczalną w wodzie sól tetrazolową lub WST-1 i odczynnik do sprzęgania elektronów.
Inkubować. W komórkach aktywnych metabolicznie system transportu elektronów błony plazmatycznej przenosi elektrony z wewnątrzkomórkowego NADH do zewnątrzkomórkowego odczynnika sprzęgania elektronów, redukując nieprzepuszczalny dla komórek barwnik WST-1 do stabilnego, ciemnożółtego, rozpuszczalnego w wodzie formazanu.
Po inkubacji wstrząsnąć płytką, aby równomiernie rozprowadzić formazan i przenieść go do płytki wielodołkowej.
Za pomocą czytnika mikropłytek zmierzyć absorbancję formazanu, wskazującą na żywotność tkanki.
Spadek absorbancji formazanu, zależny od stężenia badanego czynnika, wskazuje na zmniejszoną żywotność plastra płuc, potwierdzając cytotoksyczność badanego czynnika.
Aby przygotować mieszankę wzorcową roztworu roboczego, rozcieńczyć 25 mikrolitrów odczynnika WST-1 i 225 mikrolitrów pożywki dla każdej studzienki. Następnie odpipetować 250 mikrolitrów roztworu roboczego mieszanki głównej WST-1 do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Upewnij się, że PCLS są całkowicie pokryte odczynnikiem WST-1 podczas inkubacji.
Następnie umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min i ostrożnie potrząsaj przez 30 sekund, aby zapewnić dokładne wymieszanie odczynnika WST-1. Następnie odpipetować 100 mikrolitrów supernatantu z każdego dołka płytki 24-dołkowej na nową płaską płytkę 96-dołkową w dwóch egzemplarzach. Zmierz absorpcję każdej studzienki przy 450 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek i odejmij absorpcję przy 630 nanometrach odniesienia od absorpcji przy 450 nanometrach.