JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:34 min. • July 8th, 2025
Weź szkło nakrywkowe z komorą zawierającą komórki tuczne — komórki odpornościowe z granulkami wydzielniczymi lub SG zawierające mediatory stanu zapalnego.
Dodaj przeciwciała IgE wraz z wrażliwym na pH reporterem fluorescencyjnym i inkubuj.
Przeciwciała wiążą się z receptorami Fc na komórkach tucznych. Reportery ulegają internalizacji przez pinocytozę, a powstałe endosomy łączą się z SG.
Wyjmij nośnik. Dodaj antygen zawierający wiele epitopów wiążących IgE; Umieść szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym i zastosuj wymaganą długość fali wzbudzenia.
Kwaśne pH SG tłumi fluorescencję reporterową.
Antygen wiąże się z kompleksami receptorów IgE na powierzchni komórki, sieciując je.
Agregacja receptorów za pośrednictwem antygenu wyzwala SG do migracji w kierunku błony plazmatycznej.
Białka SNARE na błonie plazmy i SG pośredniczą w fuzji błonowej i rozładowywaniu ładunku SG, zwanym egzocytozą.
Wyższe pH pożywki powoduje alkalizację SG, indukując reportery do odzyskania fluorescencji.
Przychodzące SG łączą się z tymi ze stopkami membranowymi. Alkalizacja drugiego SG pośredniczy w odzyskiwaniu fluorescencji, potwierdzając egzocytozę związku.
Dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do komorowego szkła nakrywkowego ze świeżą pożywką hodowlaną uzupełnioną FITC-dekstranem i hoduj komórki RBL przez noc. W pierwszej kolejności należy przygotować ostateczną wersję bufora Tyrode zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie przygotuj 20x odczynnik sekretagogiczny w świeżo przygotowanym buforze.
Rozpuść chlorek amonu w proszku w buforze Tyrode'a, aby uzyskać 400-milimolowy roztwór chlorku amonu. Następnie należy odessać pożywkę z komory nakrywkowej i zastąpić ją 300 mikrolitrami wstępnie podgrzanego buforu Tyrode. Po dwukrotnym powtórzeniu procesu mycia uzupełnij komorę 300 mikrolitrami buforu Tyrode.
Następnie umieść komorę nakrywkową w komorze inkubatora mikroskopu i upewnij się, że komora jest stabilna. Włącz fluorescencyjne źródło światła i wybierz odpowiedni filtr fluorescencyjny. Gdy obszar zainteresowania znajdzie się w centrum pola view, wyłącz źródło światła.
Następnie włącz laser o długości fali 488 nanometrów, którego emisja wynosi około 500 do 550 nanometrów. Następnie skalibruj odstęp czasu między akwizycjami obrazu. Ustaw kierunek skanowania na "Dwukierunkowy". Nie dopuszczaj do uśredniania. Otwórz otwór otworkowy i ustaw rozdzielczość na 512 na 512.
Następnie zobrazuj komórki przez czas odpowiedni dla określonego typu komórki lub sekretagogi. Następnie dodaj 16 mikrolitrów z roztworu sekretagogicznego do komory i kontynuuj filmowanie. Na koniec, aby potwierdzić obecność i lokalizację dekstranu FITC w granulkach wydzielniczych, delikatnie dodaj do komory 16 mikrolitrów roztworu chlorku amonu.