Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 4:38 min • July 8th, 2025
Weź kolumnę chromatograficzną wykluczającą wielkość wypełnioną obojętną matrycą cząstek żywicy polisacharydowej. Porowate cząstki mają określoną wielkość porów.
Przepłukać kolumnę buforem równoważącym w celu optymalnego oczyszczenia.
Dodać skoncentrowany filtrat hodowlany przetworzony z kultury Mycobacterium tuberculosis — bakterii chorobotwórczej. Przesącz zawiera pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub EV i inne rozpuszczalne białka wydzielane przez bakterie.
Pojazdy elektryczne to niejednorodne, małe, kuliste konstrukcje. Zawierają makrocząsteczki i czynniki wirulencji zamknięte w dwuwarstwie lipidowej.
Próbka dostaje się do matrycy pod wpływem grawitacji. Dodaj bufor, aby umożliwić przepływ próbki przez kolumnę.
Pojazdy elektryczne nie mogą dostać się do żywicy ze względu na mały rozmiar porów, a zamiast tego poruszają się w przestrzeni międzycząsteczkowej, pokonując krótszą drogę i najpierw eluując.
Białka, mające mniejszy rozmiar, wnikają w pory, pokonują dłuższą drogę przez żywicę i eluują na końcu.
Zebrać frakcje zawierające EV do dalszej analizy.
Pozwolić, aby chromatografia wykluczająca wielkość lub kolumna SEC zrównoważyła się do temperatury pokojowej. Włącz AFC za pomocą wyłącznika zasilania z tyłu jednostki wieżowej i w razie potrzeby naciśnij przycisk SETUP na ekranie dotykowym menu głównego, aby dostosować ustawienia ogniwa obciążnikowego. Na ekranie SETUP wyrównaj karuzelę, wybierając KARUZELA, a następnie KALIBRUJ. Włóż karuzelę z 13 małymi otworami skierowanymi do góry do wieży AFC i wyreguluj karuzelę, naciskając przyciski minus lub plus tak, aby dysza płynu znajdowała się bezpośrednio nad pozycją spłukiwania.
Zdejmij zaślepki ze zrównoważonej kolumny SEC i wsuń kolumnę SEC do odpowiedniego mocowania kolumny. Ostrożnie zainstaluj go na wieży AFC. Upewnij się, że znacznik identyfikacji radiowej na kolumnie jest skierowany w stronę AFC i sprawdź, czy połączenie między kolumną a zaworem jest bezpieczne. Umieść rurkę odprowadzającą odpady w pojemniku zbiorczym. Na ekranie SETUP wybierz Harmonogram odbioru i ustaw liczbę na 13, a rozmiar na 0.5 mililitra, naciskając przyciski minus lub plus.
Pozostaw ustawienie woluminu buforu jako domyślne 2,7 mililitra, a następnie zamknij okno Harmonogram zbierania. Wybierz pozycję Rozpocznij kolekcję na ekranie głównym i potwierdź parametry kolekcji, wybierając pozycję Tak. Załaduj 13 oznaczonych 1.7-mililitrowych probówek wirówkowych z otwartymi pokrywkami i skierowanymi w stronę środka karuzeli. Przesuń AFC, wybierając przycisk OK. Następnie zamontuj zbiornik kolumny i ponownie przejdź, naciskając przycisk OK.
Wybierz opcję, aby opróżnić kolumnę, naciskając przycisk Tak, i dodaj jeden wolumin kolumny PBS filtrowanego przez 0,2 mikrometra, aby usunąć bufor magazynu. Po zakończeniu płukania przesuń AFC, naciskając OK. Umieść pokrywę karuzeli na AFC i naciśnij OK. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar bufora z kolumny. Przynieś 3 miligramy próbki 100R do 500 mikrolitrów z 1x PBS i dodaj próbkę na górze kolumny.
Przygotować jedną objętość jednej kolumny PBS przefiltrowanego 0,2 mikrometra. Przesunąć AFC i pozwolić, aby próbka spłynęła na frytę. Gdy próbka całkowicie wprowadzi się do kolumny, należy dodać przygotowany wcześniej PBS do zbiornika. Monitoruj przebieg AFC, gdy zbiera on najpierw wolumin pustek, a następnie określone frakcje. Po zakończeniu przebiegu i powrocie karuzeli do pozycji odpadu zdejmij pokrywę i rurki z frakcjami z karuzeli.
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje proces oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) z Mycobacterium tuberculosis z wykorzystaniem chromatografii wykluczania (SEC). Metodyka ta podkreśla oddzielenie pęcherzyków EVs od białek rozpuszczalnych na podstawie wielkości, co ułatwia dalsze analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Mikrobiologia
- Biochemia
Wprowadzenie
- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) są małymi, sferycznymi strukturami wydzielanymi przez bakterie.
- Mycobacterium tuberculosis to patogenna bakteria znana ze swoich czynników wirulencji.
- Chromatografia wykluczania cząsteczkowego jest techniką stosowaną do rozdzielania cząsteczek na podstawie ich wielkości.
- Zrozumienie EVs może dostarczyć wiedzy na temat komunikacji bakteryjnej oraz patogenezy.
Cel badania
- Oczyszczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) z Mycobacterium tuberculosis w celu przeprowadzenia dalszych analiz.
- Wykazanie skuteczności chromatografii wykluczania cząsteczkowego w oddzielaniu EVs od innych białek.
- Ułatwienie badania roli EVs w wirulencji bakteryjnej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie kolumny do chromatografii wykluczania z wykorzystaniem żywicy polisacharydowej.
- Przepłukanie kolumny buforem równoważącym.
- Nałożenie na kolumnę stężonego filtratu hodowli zawierającego EV.
- Zbieranie frakcji w zależności od wielkości do dalszych analiz.
Główne wyniki
- EVs zostały pomyślnie oddzielone od białek rozpuszczalnych za pomocą SEC.
- Frakcje zawierające EVs zostały zebrane do dalszych badań.
- Zastosowana metodologia wykazała skuteczność SEC w oczyszczaniu EVs.
- Analiza zebranych frakcji pozwoliła uzyskać informacje na temat składu EVs.
Wnioski
- Chromatografia wykluczania cząsteczkowego jest skuteczną metodą oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) z Mycobacterium tuberculosis.
- Badanie to pogłębia zrozumienie roli pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w patogenezie bakteryjnej.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zbadania zastosowań terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) Mycobacterium tuberculosis za pomocą chromatografii wykluczania (SEC) odpowiada na krytyczną potrzebę otrzymywania preparatów pęcherzyków o wysokiej czystości we wczesnych etapach badań nad chorobami zakaźnymi. Technika ta umożliwia niezawodną izolację EVs do późniejszej charakterystyki molekularnej, wspierając badania mechanistyczne oraz walidację celów w procesach analizy interakcji patogen-gospodarz. Oczyszczanie EVs w oparciu o metodę SEC zwiększa wiarygodność prognostyczną w badaniach translacyjnych, zapewniając standaryzowane i powtarzalne materiały wyjściowe do testów funkcjonalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia izolację nienaruszonych EV w celu analizy szlaków komunikacji bakteryjnej.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez dostarczenie czystych populacji pęcherzyków do badań nad mechanizmami działania.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez minimalizację zanieczyszczeń białkowych w preparatach pęcherzyków.
- Zwiększa pewność prognostyczną w analizach końcowych z wykorzystaniem pęcherzyków pochodzenia patogennego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane frakcje EV do opracowywania i optymalizacji testów.
- Gwarantuje powtarzalność i skalowalność procesów przesiewowych opartych na pęcherzykach.
- Umożliwia ilościowe rozdzielanie na podstawie wielkości, co wspiera rzetelną ocenę związków.
- Pozwala na ponowne wykorzystanie platformy do oczyszczania pęcherzyków z różnych szczepów bakteryjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie preparatów pęcherzyków do modeli istotnych w kontekście chorób na potrzeby translacyjnych badań nad biomarkerami.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez dostarczanie wysokiej jakości EVs.
- Zmniejsza ryzyko przy opracowywaniu celów terapeutycznych opartych na pęcherzykach dzięki zapewnieniu czystości i spójności próbek.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach badawczych nad chorobami zakaźnymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Oczyszczanie EV w oparciu o SEC znajduje się na styku wczesnych odkryć i badań przedklinicznych, dostarczając kluczowych danych dla walidacji celów, badań mechanistycznych oraz opracowywania testów.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez izolację pęcherzyków z minimalną ilością zanieczyszczeń.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych frakcji EV gotowych do analiz i badań przesiewowych związków.
- Analityka: Wspiera dalsze analizy molekularne i funkcjonalne dzięki dostarczeniu dobrze scharakteryzowanych próbek pęcherzyków.
- Badania translacyjne: Łączy studia nad pęcherzykami na etapie odkrywczym z przedkliniczną walidacją funkcjonalną i biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny proces oczyszczania, który można dostosować do różnych systemów bakteryjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechaniczną w badaniach nad pęcherzykami.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje oczyszczanie EV w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych projektach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zapewnienie wysokiej jakości materiałów wejściowych do testów funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i programów związanych z pęcherzykami z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach chromatograficznych i biologii pęcherzyków.
- Wymaga dostępu do aparatury SEC oraz infrastruktury do zbierania frakcji.
- Wymaga standaryzacji protokołów oczyszczania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwość adaptacji do różnych szczepów bakteryjnych, przy uwzględnieniu heterogeniczności rozmiaru pęcherzyków.
- Ograniczone koniecznością dokładnej kalibracji i monitorowania wydajności kolumny.
Najczęściej zadawane pytania dot. biofarmacji
Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zawierających syderofory z Mycobacterium tuberculosis
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Chromatografia wykluczania wielkości Separacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii: technika oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych na podstawie ich wielkości
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026