JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 2:24 min. • July 8th, 2025
Weźmy larwę danio pręgowanego, której wstrzyknięto zarodniki grzybów w tylnej komorze mózgu.
Makrofagi są rekrutowane do miejsca wstrzyknięcia, tworząc ciasne skupisko wokół zarodników.
Zarodniki ulegają pochłonięciu fagocytarnemu przez makrofagi.
Zarodniki te mają zdolność opierania się degradacji wewnątrz fagosomu, co pozwala im kiełkować w strzępki i indukować nekrotyczną śmierć komórek makrofaga.
Strzępki mają na swojej powierzchni odsłonięte wzory molekularne związane z patogenami lub PAMP.
Neutrofile rekrutowane do miejsca infekcji rozpoznają i wiążą PAMP. Kontakt z neutrofilami wyzwala złożony, hiperrozgałęziony fenotyp strzępek, utrudniając w ten sposób ich pochłanianie przez neutrofile i ułatwiając unikanie odporności.
Homogenizuj larwę, uwalniając żywotne zarodniki grzybów i strzępki. Odwirować w celu usunięcia resztek komórkowych i umieścić supernatant na pożywce wzrostowej.
Podczas inkubacji policz jednostki tworzące kolonie grzybów lub CFU.
Liczba CFU reprezentuje liczbę żywotnych zarodników grzybów, które uniknęły obrony immunologicznej gospodarza.
Natychmiast po wstrzyknięciu przenieś osiem larw do pojedynczych 1,7-mililitrowych probówek i poddaj je eutanazji. Przygotuj 1 mililitr PBS z ampicyliną i kanamycyną. Usuń jak najwięcej płynu z probówek z larwami. Następnie dodaj 90 mikrolitrów PBS z antybiotykami.
Homogenizuj larwy w lizerze tkankowym z prędkością 1,800 oscylacji na minutę przez 6 minut. Następnie obracaj je z prędkością 17 000 razy g przez 30 sekund. Odpipetować homogenizowaną zawiesinę z każdej probówki do środka oznakowanej płytki GMM i rozprowadzić za pomocą jednorazowego rozsiewacza w kształcie litery L, uważając, aby nie rozprowadzić się na krawędzi. Inkubuj płytki do góry nogami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 do 3 dni. Następnie policz liczbę utworzonych kolonii.