Technika zWEDGI do wizualizacji larw danio pręgowanego zakażonych patogenami grzybiczymi

Zacznij od transgenicznych larw danio pręgowanego wykazujących ekspresję znakowanych fluorescencyjnie komórek odpornościowych oznaczonych unikalnymi markerami fluorescencyjnymi w celu precyzyjnego śledzenia.

Larwom wstrzykuje się wcześniej białko czerwonej fluorescencji wyrażające zarodniki Aspergillus w ich tyłomózgowiu.

W tyłomózgowiu zarodniki grzybów naśladują miejscowy stan zapalny i przyciągają komórki odpornościowe, w tym makrofagi, które fagocytozą zarodniki w celu ich usunięcia.

Podczas gdy kilka zarodników utrzymuje się i kiełkuje w strzępki, uwalniając cząsteczki pochodzące z patogenu i przyciągając neutrofile do miejsca infekcji.

Przenieść znieczuloną larwę do komory załadowczej zawierającej podłoże urządzenia do ranienia i uwięziania danio pręgowanego w celu wzrostu i obrazowania (zWEDGI), urządzenia połączonego z komorą nawijania za pomocą kanału ograniczającego.

Zabezpiecz larwę w kanale ograniczającym w orientacji grzbietowo-bocznej w celu obrazowania tyłomózgowia.

We wczesnych stadiach czerwona fluorescencja reprezentuje zarodniki grzybów, podczas gdy zielona fluorescencja potwierdza rekrutację makrofagów do miejsca infekcji.

Z biegiem czasu rozprzestrzenianie się czerwonej fluorescencji oznacza postęp infekcji, podczas gdy pojawienie się dodatkowej niebieskiej fluorescencji wskazuje na rekrutację neutrofili.

W dniu obrazowania przygotuj jedną 3,5-milimetrową szalkę Petriego ze 100 mikromolowym PTU i jedną z E3-tricainą. Dodać E3-trikainę do komór urządzenia zWEDGI i za pomocą mikropipety P100 usunąć pęcherzyki powietrza z komór i kanału ograniczającego, a następnie usunąć nadmiar E3-trikainy na zewnątrz komór.

Odpipetować jedną larwę i przenieść ją do naczynia z E3 PTU, a następnie przenieść do E3-tricaine z jak najmniejszą ilością płynu. Po 30 sekundach przenieść znieczulone larwy do komory załadowczej urządzenia do ranienia i uwięzienia.

Usunąć E3-trikainę z komory do nawijania i wypuścić ją do komory załadowczej, aby przesunąć ogon larw do kanału ograniczającego. Upewnij się, że larwa jest umieszczona po swojej bocznej, grzbietowej lub grzbietowo-bocznej stronie, tak aby można było zobrazować tyłomózgowie za pomocą odwróconej soczewki obiektywu.

Po zobrazowaniu larwy za pomocą mikroskopu konfokalnego, uwolnij E3-trikainę do komory zranienia, aby wepchnąć larwę z kanału ograniczającego do komory ładowania. Podnieś larwę i przenieś ją z powrotem do naczynia z E3-tricaine, a następnie przenieś ją do naczynia z E3 PTU z jak najmniejszą ilością płynu. Opłucz go w PTU i przenieś z powrotem do płytki 48-dołkowej.