Test adherencji opsonowej do oceny opsonizacji bakterii otoczkowanych przez przeciwciała antykapsułkowe

Weź zawiesinę chemicznie zabitego, znakowanego fluorescencyjnie Bacillus anthracis.

Kapsułka bakteryjna, składająca się głównie z kwasu poligamma-glutaminowego, zapewnia ochronę przed fagocytozą.

Weźmy surowice naczelnych innych niż ludzie, inaktywowane termicznie w celu zniszczenia białek dopełniacza. Surowice te, wyizolowane od zwierząt uodpornionych szczepionką na bazie kapsułek bakteryjnych, zawierają przeciwciała antykapsułkowe.

Dodać chemicznie zabitą zawiesinę bakteryjną do surowicy. Przeciwciała specyficznie wiążą się z kapsułkami bakteryjnymi, ułatwiając opsonizację bakterii i oznaczając je do eliminacji przez komórki fagocytarne. Dodaj standardowe białka dopełniacza, aby zwiększyć opsonizację.

Przenieś opsonizowane bakterie do przylegających makrofagów - komórek fagocytarnych. Krótko inkubować.

Przeciwciała i białka dopełniacza na bakteriach wiążą się odpowiednio z receptorami Fc makrofagów i receptorami dopełniacza, sprzyjając przyleganiu bakterii.

Usuń nośnik. Umyć buforem, aby usunąć nieprzylegające bakterie.

Napraw komórki, aby zachować integralność komórkową.

Użyj barwnika fluorescencyjnego, aby oznaczyć makrofagi.

Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego obserwuj bakterie fluorescencyjne przylegające do różnie fluorescencyjnych makrofagów, potwierdzając skuteczną opsonizację bakterii przez przeciwciała antykapsułkowe.

Umyj inaktywowany materiał bakteryjny trzy razy w PBS, aby usunąć utrwalacz. Dodać roztwór FITC o końcowym stężeniu 75 mikrogramów na mililitr. Powoli mieszaj mieszaninę przez 18 do 24 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj bakterie jak poprzednio, aby usunąć nadmiar FITC.

Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś pałeczki w PBS w tej samej objętości początkowej. Podwielokrotność i przechowuj pałeczki w temperaturze -20 stopni Celsjusza do czasu użycia. Inaktywuj termicznie niewielką objętość surowic testowych od naczelnych w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut, w bloku grzewczym lub maszynie do PCR. Rozmrozić i umyć bakterie znakowane FITC za pomocą PBS dwa razy, granulując 15 000 razy g przez trzy do pięciu minut. Wznawianie w PBS w tym samym woluminie początkowym.

Na 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem seryjnie rozcieńczyć surowice testowe w pożywce komórkowej. Do kolejnej 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonych surowic testowych do każdej studzienki. Następnie dodaj 10 mikrolitrów świeżo rozpuszczonego zestawu dla młodego królika.

Do tabliczki numer trzy dodaj odpowiednią objętość pałeczek znakowanych zgodnie z FITC dla wielokrotności infekcji 20, na przykład w objętości zawierającej 50 000 razy 20 pałeczek na 50 000 komórek. Uzupełnij każdą studzienkę na płytce numer trzy odpowiednią objętością pożywki komórkowej do łącznej ilości 105 mikrolitrów. Inkubować płytkę numer trzy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w obecności 5% CO2 z wilgotnością w celu opsonizacji pałeczek.

Umieść tabliczkę numer jeden, która zawiera przylegające komórki, na bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj pipetera wielokanałowego, aby usunąć zużyte medium ze studzienek i szybko zastąp je 100 mikrolitrami opsonizowanych bakterii z płytki numer trzy, upewniając się, że podczas pipetowania w studzienkach nie powstają pęcherzyki. Aby nie zakłócać monowarstwy komórek, dodaj objętość po bokach studzienek.

Inkubować płytkę numer jeden w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO₂ i wilgotnością przez 30 minut w celu przestrzegania zaleceń. Umyj każdą studzienkę pięć razy 150 mikrolitrami PBS na bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć nieprzyczepione pałeczki. Pipetę należy przesunąć z boku studzienek, aby upewnić się, że komórki nie zostaną przypadkowo rozproszone podczas mycia. Dodaj 150 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do każdej studzienki i utrwal komórki na jedną godzinę.

Po dwukrotnym umyciu komórek PBS, wymieszaj dwa mikrolitry pomarańczowego barwnika komórkowego o wysokiej zawartości w 10 mililitrach PBS. Następnie dodaj 150 mikrolitrów tego roztworu barwiącego do utrwalonych komórek i inkubuj przez 30 minut w temperaturze otoczenia. Umieść tabliczkę numer jeden na stole montażowym i skup się na komórkach, używając jasnego pola lub kontrastu fazowego.

Na karcie Akwizycja wybierz format 96-dołkowy jako ustawienie płytki, a następnie wybierz Ustawienia kanału. Następnie wybierz Ustawienie na tryb kafelków. Wskaż liczbę obrazów, które mają zostać pobrane. Zmień tryb akwizycji na czarno-biały lub monochromatyczny i ustaw kategoryzację na co najmniej 2 na 2. Włącz autofokus lub moduł ustawiania ostrości. Wskaż, jak często ma być wykonywana funkcja autofokusa.

Następnie włącz funkcję z-stack, jeśli jest dostępna, wskaż liczbę z-stacków, które uchwycą grubość monowarstwy komórki i przylegających pałeczek. Wyznacz folder plików, w którym chcesz zapisać obrazy. Teraz uruchom automatyczny program do obrazowania. Gromadzenie i analizowanie danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.