Ocena kontrolowanej aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu MHC

Zacznij od pokrycia szkła nakrywkowego biotynylowaną poli-L-lizyną, aby uzyskać powierzchnię bogatą w biotynę.

Następnie wprowadź streptawidynę – białko, które wiąże się z biotyną, tworząc molekularny most dla kolejnych interakcji.

Następnie dodaj biotynylowane peptydy fotoklatkowe związane z głównymi kompleksami zgodności tkankowej - pMHC wraz z cząsteczkami adhezyjnymi.

Biotynylowane ligandy pMHC i cząsteczki adhezyjne oddziałują z określonymi regionami streptawidyny, umożliwiając ich unieruchomienie.

Następnie kilkakrotnie umyj szkło nakrywkowe buforowaną solą fizjologiczną i wprowadź limfocyty T.

Obecność fotoklatki, światłoczułej grupy chemicznej przywiązanej do określonej reszty peptydu, utrudnia spontaniczne wiązanie receptora limfocytów T z peptydem.

W celu kontrolowanej aktywacji limfocytów T należy wystawić peptydy w fotoklatkach na działanie światła ultrafioletowego.

Światło UV zrywa wiązanie chemiczne między kompleksem fotoklatka-peptyd, odsłaniając natywną formę peptydu.

Receptory limfocytów T identyfikują i przyłączają się do odsłoniętych peptydów, podczas gdy integryny wiążą się z cząsteczkami adhezyjnymi, wywołując aktywację limfocytów T.

Rozpocznij od dodania biotynylowanej poli-L-lizyny lub bio-PLL rozcieńczonej od 1 do 500 w destylowanej wodzie dejonizowanej do 8-dołkowego szkła nakrywkowego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć destylowaną wodą dejonizowaną, a następnie suszyć przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Powierzchnie pokryte bio-PLL należy zablokować buforem blokującym składającym się z soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES z 2% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji należy usunąć bufor blokujący z powierzchni pokrytych bio-PLL, nie dopuszczając do wyschnięcia studzienek. Następnie dodaj streptawidynę i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po godzinie umyj powlekane powierzchnie w HBS. Napełnij i odwróć studzienki suwakowe komory 4 do 5 razy, usuwając HBS ze studzienek. Nie pozwól, aby studzienki wyschły.

Dodaj specyficzne biotynylowane, fotoaktywowane peptydy, główne ligandy kompleksu zgodności tkankowej i cząsteczki adhezyjne dla limfocytów T CD4-dodatnich lub komórek CD8-dodatnich do powierzchni pokrytych bio-PLL. Chronić przed światłem i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyj jak poprzednio i pozostaw w HBS, aż będzie gotowy do wysiewu. Na koniec dodaj 200 000 limfocytów T CD4-dodatnich lub CD8-dodatnich, wyrażając odpowiedni TCR do odpowiednich studzienek i pozwól komórkom przylegać w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Gdy komórki przyczepią się do powierzchni i rozprzestrzenią się na niej, są gotowe do fotoaktywacji i obrazowania. Do akwizycji obrazu należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego z odwróconym całkowitym odbiciem wewnętrznym wyposażonego w soczewkę obiektywową 150x zgodną z promieniowaniem UV. Monitoruj sondy zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym, używając odpowiednio laserów wzbudzających 488 nm i 561 nm.

Po zamontowaniu szkiełka komory zawierającego limfocyty T, wyreguluj ustawienia mikroskopu, aby w razie potrzeby uzyskać oświetlenie TIRF lub epifluorescencyjne. W trybie na żywo wybierz pole komórek, które wyrażają interesujące nas sondy fluorescencyjne. Ustal obszary w skali mikronowej do fotoaktywacji pod pojedynczymi komórkami za pomocą sterowania programowego. Następnie rozpocznij akwizycję.

Zazwyczaj zdobywa się 80 punktów czasowych w odstępie 5 sekund między każdym. Pozostawia to czas na sekwencyjne ekspozycje 488 nanometrów i 563 nanometrów w przypadku eksperymentów dwukolorowych. Następnie, po uzyskaniu 10 punktów czasowych, aktywuj fotograficznie wybrane obszary, otwierając cyfrową migawkę przysłony na 1 do 1,5 sekundy. Po zakończeniu tworzenia filmu poklatkowego wybierz nowe pole komórek i powtórz proces.