Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo do badania biodystrybucji przeciwciał

Weźmy mysi model raka piersi. Guzy gruczołu sutkowego obejmują komórki rakowe, fibroblasty związane z rakiem, adipocyty, komórki odpornościowe i unaczynienie guza.

Wstrzyknąć dożylnie przeciwciała swoiste dla nowotworu sprzężone z fluoroforem.

Po dotarciu do naczynia krwionośnego guza przeciwciała wiążą się ze specyficznymi dla nowotworu białkami transbłonowymi na śródbłonku naczynia i pobliskich komórkach rakowych.

Chirurgicznie odizolować gruczoł sutkowy i zanurzyć go w pożywce zamrażającej.

Uzyskać krioskwizyty na szkiełku i spłukać buforem w celu usunięcia pożywki zamrażającej.

Napraw sekcje, aby zachować architekturę tkanki. Zastosuj detergent w celu wzmocnienia barwienia immunologicznego i roztwór blokujący, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał nieswoistych.

Wprowadź przeciwciało pierwszorzędowe specyficzne dla cząsteczek adhezyjnych na śródbłonku naczynia krwionośnego oraz przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem, które wiąże się z przeciwciałem pierwotnym, znakując naczynia krwionośne.

Nałożyć podłoże mocujące na szkiełko podstawowe i umieścić szkiełko nakrywkowe.

Pod mikroskopem konfokalnym oceń biodystrybucję przeciwciał specyficznych dla nowotworu w i wokół znakowanego fluorescencyjnie naczynia guza

Po znieczuleniu zgodnie z opisem w protokole tekstowym należy przygotować się do inokulacji roztworów przeciwciał do żyły ogonowej. Zdezynfekuj ogon zwierzęcia, przecierając go trzykrotnie chusteczką nasączoną alkoholem. Rozszerz żyły ogonowe, ogrzewając się poduszką rozgrzewającą przez około 30 sekund; Unikaj podgrzewania całego zwierzęcia. Za pomocą cewnika łopatkowego o rozmiarze 27 włóż igłę motylkową do jednej z dwóch bocznych żył ogonowych.

Wizualizuj cofanie się krwi do cewnika, aby upewnić się, że igła jest prawidłowo umieszczona, tak aby roztwory w pełni dostały się do zwierzęcia, a nie zostały schwytane w ogon.

Użyj kawałka taśmy chirurgicznej, aby ostrożnie przymocować ogon z włożoną igłą do stolika. Przepłukać cewnik 25 mikrolitrami sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Następnie wstrzyknąć roztwór przeciwciała do cewnika za pomocą strzykawek insulinowych. Ponownie przepłukać cewnik 25 mikrolitrami sterylnego PBS. Usuń igłę z ogona i uciskaj, aby zatrzymać krwawienie.

Przeprowadzić humanitarną eutanazję myszy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, i ułożyć mysz w pozycji leżącej. Użyj nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby wyciąć tkanki nowotworowe. Użyj kleszczy, aby chwycić tylko zewnętrzną warstwę skóry między zestawem gruczołów sutkowych znajdujących się najbliżej ogona i wykonać małe nacięcie nożyczkami chirurgicznymi. Wprowadź zamknięte nożyczki do nacięcia i powoli otwórz końcówkę, aby ostrożnie oddzielić skórę od leżącej poniżej błony ściany brzucha, utrzymując ją nienaruszoną.

Wykonaj pionowe nacięcie w górę brzucha, kontynuując oddzielanie skóry od błony wewnętrznej. Pomiędzy trzecim a czwartym gruczołem sutkowym wykonaj poziome nacięcie w poprzek brzucha, aby umożliwić cofnięcie skóry i wizualizację gruczołów sutkowych. Chwytając każdy guz lub normalny gruczoł kleszczami, ostrożnie odetnij przyczepioną skórę za pomocą nożyczek chirurgicznych.

Umieść wycięte tkanki w jednorazowych formach bazowych do tkanek, które są wstępnie oznakowane i wypełnione medium do osadzania w optymalnej temperaturze cięcia. Szybko zamroź foremki, umieszczając je na suchym lodzie. W celu zbadania dostarczania poza celem należy wyciąć inne tkanki lub narządy będące przedmiotem zainteresowania. Za pomocą kriostatu pokrój zamrożone bloki tkanek o grubości 10 mikronów i umieść sąsiednie sekcje na wstępnie oznakowanych szkiełkach adhezyjnych.

Płukać zamrożone szkiełka tkankowe PBS o temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby usunąć podłoże do zatapiania. Odgranicz skrawki tkanek za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego, aby zmniejszyć objętość roztworów potrzebnych podczas barwienia. Utrwal skrawki tkanki 4% roztworem paraformaldehydu przez 5 minut. Po płukaniu szkiełek w PBS przez 5 minut, należy przepuszczać skrawki tkanek 0,5% Triton X-100 w PBS przez 15 minut. Ponownie płukać szkiełka w PBS przez 5 minut.

Zablokuj tkanki PBS zawierającym 3% wagowo na objętość albuminy surowicy bydlęcej i 5% objętości surowicy koziej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po płukaniu szkiełek w PBS przez 5 minut, należy inkubować skrawki z podstawowymi przeciwciałami prowadzącymi rejestrację, takimi jak powszechny marker jądrowy, naczyniowy lub cytoplazmatyczny. W tym przypadku stosuje się CD31 przeciwko myszom szczurom w rozcieńczeniu od 1 do 100 w roztworze blokującym. Preparaty z przeciwciałem pierwotnym pozostawia się na noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chroniąc przed odwodnieniem na tacy na szkiełkach.

Po inkubacji przepłukać szkiełka w PBS przez 5 minut trzy razy. Zmieniaj PBS za każdym razem. Inkubować szkiełka z przeciwciałami drugorzędowymi, aby oznaczyć przeciwciała pierwszorzędowe. W tym zastosowaniu uwidocznij przeciwciało anty-B7-H3 za pomocą sprzężonego koziego przeciwciała anty-królika AlexaFluor-546 i uwidocznij CD31 z kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko szczurom AlexaFluor-488 w roztworze blokującym. Chroń szkiełka przed światłem i odwodnieniem na tacy na szkiełkach przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Po przepłukaniu szkiełek w PBS, tak jak poprzednio, nałóż jedną kroplę podłoża mocującego na środek wycinka tkanki. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia. Kontynuuj obrazowanie mikroskopią konfokalną i ilościową analizę obrazu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.