JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 4:34 min • July 8th, 2025
Weź wielodołkową płytkę zawierającą przylegające komórki kostniakomięsaka na szkiełkach nakrywkowych.
Te komórki raka kości są wstępnie traktowane substancją chemiczną wywołującą stres, co powoduje tworzenie się granulek stresu.
Granulki stresu to cytoplazmatyczne organelle bez błony zawierające nietranslujące mRNA, małe podjednostki rybosomalne, białka wiążące RNA lub RBP, czynniki związane z translacją i białka sygnałowe.
Wyrzucić pożywkę i umyć komórki buforem. Napraw komórki, aby zachować morfologię komórkową.
Przepuszczalność komórek w celu uzyskania dostępu do celów wewnątrzkomórkowych. Dodaj białka blokujące, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał nieswoistych.
Wprowadź przeciwciała pierwszorzędowe, które wiążą się ze specyficznymi RBP i czynnikami związanymi z translacją w ziarnistościach stresu.
Inkubować z różnymi przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem i barwnikiem Hoechsta.
Przeciwciała drugorzędowe wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi związanymi z białkami związanymi z ziarnistościami stresu, podczas gdy cząsteczki Hoechst barwią DNA.
Zamontuj szkiełka nakrywkowe zawierające komórki za pomocą nośnika montażowego.
Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego obserwuj komórki, aby uwidocznić i określić ilościowo granulki stresu, które pojawiają się jako ogniska fluorescencyjne charakteryzujące się kolokalizacją powiązanych białek.
Aby utrwalić komórki, usuń pożywkę z dołków i umyj komórki około 250 mikrolitrami PBS. Dodaj około 250 mikrolitrów buforowanego 4% roztworu paraformaldehydu, aby utrwalić komórki, upewniając się, że górna część szkiełka nakrywkowego jest całkowicie pokryta. Następnie pozostaw talerz na bujaku ławkowym w temperaturze pokojowej na 15 minut. Następnie usuń i odpowiednio wyrzuć paraformaldehyd.
Dodaj około 250 mikrolitrów lodowatego metanolu, aby przepuszczalność i spłaszczenie komórek. Inkubuj płytkę przez dodatkowe 5 minut w temperaturze pokojowej na bujaku. Po zakończeniu przepuszczalności wyrzuć metanol i zablokuj komórki, stosując około 250 mikrolitrów buforu blokującego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, dodając 12 mikrolitrów przeciwciał przeciwko G3BP1, eIF4G i eIF3b do 3 mililitrów buforu blokującego.
Dodać 250 mikrolitrów roztworu przeciwciała do każdego dołka 24-dołkowej płytki. Inkubować płytkę na bujaczku przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po 1 godzinie inkubacji usunąć roztwór przeciwciała i przemywać komórki około 250 mikrolitrami PBS przez 5 minut. Następnie dodaj 12 mikrolitrów przeciwciał anty-mysich Cy2, anty-króliczych Cy3 i anty-kozich Cy5 wraz z 3 mikrolitrami barwnika Hoechst do 3 mililitrów buforu blokującego, aby przygotować wtórny roztwór przeciwciała.
Dodać 250 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciała do każdej studzienki i przykryć płytkę, aby chronić próbki przed światłem. Inkubuj płytkę na bujaku w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po zakończeniu inkubacji usuń roztwór przeciwciała i przemyj komórki PBS przez 5 minut. Podgrzej medium montażowe w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby zmniejszyć lepkość. Następnie, za pomocą wstępnie naciętej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, umieść 25 mikrolitrów podłoża montażowego na oznakowanym szkiełku podstawowym.
Za pomocą cienkich kleszczy przenieś szkiełko nakrywkowe ze studzienki na szkiełko, odwracając górę tak, aby komórki były skierowane w stronę medium montażowego. Użyj czystej końcówki P200, aby docisnąć szkiełko nakrywkowe. Po zamontowaniu wszystkich szkiełek nakrywkowych usuń nadmiar podłoża mocującego, mocno dociskając chusteczkę laboratoryjną do szkiełka. Następnie przepłucz szkiełko wodą i natychmiast osusz je ponownie chusteczką laboratoryjną.