Kwantyfikacja poziomów mediatorów immunologicznych w płynie z błony śluzowej człowieka

Rozmrozić bibuły filtracyjne zawierające wchłonięty płyn z błony śluzowej nosa na lodzie, aby zapobiec degradacji próbki.

Płyn składa się z mediatorów immunologicznych, w tym chemokin i cytokin.

Zanurz bibuły filtracyjne w buforze. Przenieść zawartość do filtrów probówkowych. Odwirować w celu wymycia płynu wyściełającego błonę śluzową z bibuły filtracyjnej.

Dodaj przefiltrowany ekstrakt z nosa do płytki testowej z wzorem szeregu przeciwciał wychwytujących specyficznych dla mediatora.

Mediatory immunologiczne wiążą się z odpowiadającymi im przeciwciałami.

Wprowadź przeciwciała detekcyjne znakowane kompleksem rutenu, które wiążą się z odpowiednimi mediatorami.

Dodaj bufor na bazie trisu zawierający tripropyloaminę lub TPA.

Kiedy potencjał jest przyłożony do elektrod, kompleks rutenu i TPA ulegają utlenianiu.

Powstały rodnik TPA wzbudza kompleks rutenu.

Po powrocie do stanu podstawowego kompleks rutenu emituje fotony.

Zmierzone natężenie światła jest proporcjonalne do stężenia specyficznego mediatora immunologicznego w płynie błony śluzowej.

W celu ilościowego określenia mediatora immunologicznego dróg oddechowych należy umieścić na lodzie do 10 próbek z ujemnej temperatury 80 stopni Celsjusza i zapisać ich numery identyfikacyjne. Po rozmrożeniu próbek zanurzyć obie bibuły filtracyjne na osobę badaną w 150 mikrolitrach świeżo przygotowanego buforu na bibułę filtracyjną.

Uzupełnij go jedną kompletną tabletką inhibitora proteazy na 25 mililitrów podstawowego roztworu buforowego. Przenieść próbki do wytrząsarki płytkowej z prędkością 400 obr./min na 5 minut. Przenieść bufor i bibułę filtracyjną do kubków poszczególnych filtrów z rurki z octanu celulozy.

Odwirować próbki, aby zebrać przefiltrowany ekstrakt z nosa na dnie probówek do mikrowirówek. Następnie wyjmij kubki i umieść probówki na lodzie. Następnie przenieś 150-mikrolitrowe porcje ekstraktu z nosa do indywidualnych studzienek płytek magazynujących o niskim poziomie wiązania białka i przechowuj płytki w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. Następnie zmierz stężenie interesujących nas mediatorów immunologicznych nosa za pomocą multipleksowanej matrycy opartej na elektrochemiluminescencji o wysokiej czułości, zgodnie ze standardowymi protokołami testów.