Test do ilościowego określania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami za pośrednictwem przeciwciał

Weźmy erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum. Oznacz DNA pasożyta barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji pasożyta.

Inkubuj te zakażone pasożytami erytrocyty z surowicami od osób narażonych na malarię. Komórki te wykazują na swojej powierzchni antygeny pasożytów, które przyłączają się do naturalnie nabytych ludzkich przeciwciał IgG w surowicach, opsonizując komórki do fagocytozy.

Przenieś opsonizowane erytrocyty zakażone pasożytem na pokrytą białkiem płytkę wielodołkową zawierającą zawiesinę monocytów pochodzenia ludzkiego - lub komórek fagocytarnych.

Podczas inkubacji receptory Fc-gamma na monocytach oddziałują z erytrocytami opsonizowanymi IgG, wywołując pochłanianie erytrocytów w fagosomach.

Po inkubacji odwirować płytkę, aby zapobiec dalszym interakcjom komórkowym i zatrzymać fagocytozę.

Odrzucić supernatant. Leczyć roztworem lizy chlorku amonu, selektywnie rozrywając niefagocytozowane zakażone erytrocyty bez wpływu na monocyty.

Dodaj bufor zawierający surowicę, aby zatrzymać proces lizy. Odwirować i odrzucić supernatant zawierający lizowane erytrocyty.

Ponownie zawiesić monocyty w buforze.

Wykonaj cytometrię przepływową, aby określić ilościowo monocyty, które wykazują fluorescencję z erytrocytów zakażonych pasożytem w ich wnętrzu, potwierdzając ich fagocytozę za pośrednictwem przeciwciał.

Dostosuj oczyszczoną zakażoną zawiesinę erytrocytów 3,3 razy 10 do 7 komórek na mililitr w pożywce do hodowli pasożytów zawierającej bromek etydyny do końcowego stężenia 2,5 mikrograma na mililitr. Następnie usunąć roztwór blokujący z jednej płytki 96-dołkowej, wrzucając ją do pojemnika na odpady. Następnie usuń nadmiar na ręczniku papierowym i dodaj 30 mikrolitrów zawiesiny erytrocytów zakażonej bromkiem etydyny do wszystkich dołków w górnej połowie płytki z wyjątkiem jednego. Dodaj 30 mikrolitrów pożywki do hodowli pasożytów do pustej studzienki i inkubuj płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.

Pod koniec inkubacji dodać 170 mikrolitrów pożywki do hodowli pasożytów do każdej studzienki i rozprowadzić zakażone erytrocyty na dnie płytki przez odwirowanie. Usunąć supernatant przez wrzucenie płytki do pojemnika na odpady i umyć zakażone erytrocyty znakowane bromkiem etydyny jeszcze dwa razy 200 mikrolitrami pożywki do hodowli pasożytów na studzienkę, jak właśnie pokazano.

Po drugim przemyciu należy użyć pipety wielokanałowej, aby ostrożnie usunąć całą objętość supernatantu z każdej studzienki, nie naruszając osadów, i ponownie zawiesić zakażone erytrocyty znakowane bromkiem etydyny w 30 mikrolitrach roztworu przeciwciała, w tym w odpowiednich kontrolach i próbkach testowych przygotowanych wcześniej w pożywce do hodowli pasożytów. Następnie umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 45 minut, chroniąc ją przed światłem.

Podczas opsonizacji zakażonych erytrocytów należy zebrać komórki THP-1 przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 12 mililitrach świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórek THP-1.

Po drugim odwirowaniu ponownie zawieś osad w 1 mililitrze pożywki do hodowli komórek THP-1 w celu zliczenia i dostosuj stężenie komórek do 5 razy 10 do 5 komórek na mililitr w pożywce do hodowli komórek THP-1. Usuń roztwór blokujący z drugiej 96-dołkowej płytki i dodaj 100 mikrolitrów komórek THP-1 do każdej studzienki. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Pod koniec inkubacji opsonizacji dodać 170 mikrolitrów pożywki do hodowli pasożytów do każdego dołka płytki opsonizacyjnej i osadzać zakażone erytrocyty na dnie płytki przez odwirowanie. Umyj opsonizowane, zakażone erytrocyty dwa razy 200 mikrolitrami pożywki do hodowli pasożytów na studzienkę za pomocą wielokanałowej pipety, aby ostrożnie usunąć supernatant po drugim płukaniu.

Ponownie zawiesić opsonizowane, zakażone erytrocyty w 100 mikrolitrach wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórek THP-1 na dołek i przenieść 50 mikrolitrów każdej opsonizowanej, zakażonej zawiesiny erytrocytów do odpowiedniego dołka na płytce fagocytozy. Po dodaniu wszystkich komórek umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na nie dłużej niż 40 minut, chroniąc ją przed światłem.

Pod koniec inkubacji zatrzymaj fagocytozę przez odwirowanie w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki ze 150 mikrolitrami roztworu lizującego chlorku amonu o temperaturze pokojowej na studzienkę. Dokładnie po trzech minutach dodaj 100 mikrolitrów lodowatego 2% FBS do PBS, aby zatrzymać lizę, i osadź nienaruszone komórki przez odwirowanie.

Następnie umyj komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami świeżego, lodowatego 2% FBS w PBS, na studzienkę, na pranie. Po ostatnim myciu ponownie zawieś osad komórkowy w 200 mikrolitrach świeżego, lodowatego 2% FBS w PBS na studzienkę.

W celu akwizycji i analizy cytometrii przepływowej natychmiast załaduj komórki do cytometru przepływowego i użyj liniowego wykresu rozproszenia do przodu w porównaniu z liniowym rozrzutem bocznym dla studzienek bez zakażonych erytrocytów do bramowania komórek THP-1. Uzyskaj 10 000 zdarzeń w tej bramie i użyj komórek THP-1 z zakażonymi erytrocytami opsonizowanymi kontrolą pozytywną, aby ustawić wykres histogramu do pomiaru intensywności fluorescencji bromku etydyny.

W celu analizy otwórz liniowy wykres rozrzutu do przodu i liniowego rozrzutu bocznego dla studzienek bez zakażonych erytrocytów i bramki komórek THP-1. Następnie ustaw dodatnią bramkę w histogramie FL3 i skopiuj te bramki do wszystkich innych dołków na próbki, aby określić procent komórek THP-1 dodatnich pod bromkiem etydyny.