Test in vitro do pomiaru aktywności proteazy neutrofilowej seryny za pomocą reportera fluorescencyjnego

Weź mikropłytkę zawierającą proteazy neutrofilowo-serynowe lub NSP. Te rozpuszczalne enzymy o aktywności proteolitycznej, wydzielane przez neutrofile, działają w reakcjach zapalnych.

Dodaj fluorescencyjne sondy reporterowe z motywem rozpoznawania, który działa jako miejsce rozszczepienia dla NSP. Sondy są sprzężone z fluoroforem dawcy i akceptorem.

Po wzbudzeniu przez określoną długość fali fluorofor donorowy emituje energię. Ze względu na bliskość donora, fluorofor akceptorowy pochłania energię i emituje fluorescencję o innej długości fali.

Wykrywaj sygnały dawcy i akceptora oddzielnie i obliczaj stosunek dawców do akceptorów, aby ocenić aktywność NSP. Niski współczynnik wskazuje na wygaszanie fluorescencji donora przy braku rozszczepienia sondy.

NSP rozpoznają i rozcinają motyw rozpoznawania na sondach, zwalniając akceptor.

Odległość od akceptora umożliwia emisję fluorescencji z fluoroforu donorowego, zwiększając stosunek donoru do akceptora. Wysoki współczynnik wskazuje na efektywne rozszczepianie sondy przez NSP.

Rozmrozić enzymy na lodzie i ustawić krzywą wzorcową enzymu zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Równolegle z preparatem wzorcowym rozcieńczyć próbki plwociny w buf