JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 2:59 min. • July 8th, 2025
Weź mikropłytkę zawierającą proteazy neutrofilowo-serynowe lub NSP. Te rozpuszczalne enzymy o aktywności proteolitycznej, wydzielane przez neutrofile, działają w reakcjach zapalnych.
Dodaj fluorescencyjne sondy reporterowe z motywem rozpoznawania, który działa jako miejsce rozszczepienia dla NSP. Sondy są sprzężone z fluoroforem dawcy i akceptorem.
Po wzbudzeniu przez określoną długość fali fluorofor donorowy emituje energię. Ze względu na bliskość donora, fluorofor akceptorowy pochłania energię i emituje fluorescencję o innej długości fali.
Wykrywaj sygnały dawcy i akceptora oddzielnie i obliczaj stosunek dawców do akceptorów, aby ocenić aktywność NSP. Niski współczynnik wskazuje na wygaszanie fluorescencji donora przy braku rozszczepienia sondy.
NSP rozpoznają i rozcinają motyw rozpoznawania na sondach, zwalniając akceptor.
Odległość od akceptora umożliwia emisję fluorescencji z fluoroforu donorowego, zwiększając stosunek donoru do akceptora. Wysoki współczynnik wskazuje na efektywne rozszczepianie sondy przez NSP.
Rozmrozić enzymy na lodzie i ustawić krzywą wzorcową enzymu zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Równolegle z preparatem wzorcowym rozcieńczyć próbki plwociny w buforze aktywacyjnym. Na czytniku płytek ustaw długość fali wzbudzenia dla sondy NE FRET NEmo-1 na 354 nanometry, a długość fali emisji na 400 nanometrów dla donora i 490 nanometrów dla akceptora.
W przypadku sondy CG FRET sSAM ustaw długość fali wzbudzenia na 405 nanometrów, a emisję na 485 nanometrów dla dawcy i 580 nanometrów dla akceptora. Dodać 40 mikrolitrów próbek, wzorców lub półfabrykatów do dołków czarnej 96-dołkowej płytki półpowierzchniowej i dodać mieszankę główną.
Uruchom czytnik płytek i zapisuj wzrost stosunku dawcy do akceptora co 60 do 90 sekund przez co najmniej 20 minut lub do momentu, gdy wzrost sygnału osiągnie plateau. Wyeksportuj dane i oblicz stosunek dawcy do akceptora, dzieląc RFU dawcy przez RFU akceptora dla każdego punktu czasowego i próbki. Następnie oblicz średni stosunek dawcy do akceptora i odchylenie standardowe. Określ nachylenie w obrębie liniowego wzrostu zmiany stosunku dawcy do akceptora.